《Stem Cell Reports》：Development and validation of a long-term co-maturation protocol for human stem cell-derived microglia and neuronal networks
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摘要：小胶质细胞-神经元相互作用在多种中枢神经系统疾病中发挥关键作用。利用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的技术已被开发用于模拟人类脑细胞，旨在理解其功能。为了有效研究神经-免疫相互作用并探究小胶质细胞对神经元网络发育和功能的贡献，小胶质细胞和神经元应共同成
摘要：小胶质细胞-神经元相互作用在多种中枢神经系统疾病中发挥关键作用。利用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的技术已被开发用于模拟人类脑细胞，旨在理解其功能。为了有效研究神经-免疫相互作用并探究小胶质细胞对神经元网络发育和功能的贡献，小胶质细胞和神经元应共同成熟，从而在整个分化过程中实现长期相互作用。在此，研究人员提出了一种共成熟方案，该方案能够稳健地生成包含hiPSC来源小胶质细胞的谷氨酸能神经元网络。研究人员使用单细胞转录组学、成像和神经元活动读数验证了长期共培养。在该方案中，星形胶质细胞是小胶质细胞长期存活及其整合到神经元网络中所必需的。研究人员的共成熟方法诱导了典型的分枝状小胶质细胞形态和特征性的小胶质细胞-神经元相互作用。与小胶质细胞单一培养相比，稳态标记物如P2RY12和TMEM119以及神经元重塑相关基因的表达上调，这突显了环境在体外生成和维持情境依赖性小胶质细胞特征的必要性。在本稿件中，研究人员包含了共成熟方法的完整优化过程、方案的详细描述、实践指南和故障排除技巧。研究人员的共成熟模型为评估人类小胶质细胞在健康和疾病状态下调节神经元功能和发育中的作用提供了一个强大的工具。
**论文解读：人类干细胞来源小胶质细胞与神经元网络的长期共成熟模型**
**研究背景与存在问题**
神经-免疫相互作用对于大脑在健康和疾病状态下的功能至关重要。小胶质细胞作为大脑的组织驻留免疫细胞，处于中枢神经系统（CNS）神经元和免疫活动的交汇点。它们通过持续监测CNS来塑造和控制神经元回路。除了对危险信号（如启动炎症反应和吞噬作用）作出经典髓系反应外，小胶质细胞与神经元的持续动态相互作用被认为是其功能和CNS功能的核心。过去十年中，突触重塑等机制已被反复强调，并被推测是涉及神经发育、神经炎症和神经退行性疾病的主要机制。因此，理解小胶质细胞功能、小胶质细胞-神经元串扰及其在CNS疾病中的作用是当前的研究重点。
然而，解析这些过程面临若干挑战：(1) 小胶质细胞呈现多种状态，其功能具有情境依赖性，因此需要能够再现体内小胶质细胞表型的模型。(2) 小胶质细胞功能和胶质细胞-神经元通讯具有物种特异性，因此需要人类模型来补充啮齿动物体内模型。(3) 小胶质细胞-神经元相互作用快速且动态，基于其区域背景，模型应能随时间测量这种相互作用。(4) 这些相互作用发生在亚细胞水平，模型应提供分析树突和突触水平神经元-小胶质细胞相互作用的分辨率。(5) 这些相互作用的最终输出是神经元功能，模型应能测量神经元-小胶质细胞相互作用对神经元网络活动的影响。现有模型，包括小胶质细胞系、死后组织、啮齿动物模型和人类诱导多能干细胞（hiPSC）模型，各有优缺点。为了补充这些模型，研究人员优化了一种hiPSC来源的神经元-小胶质细胞共成熟模型，旨在解决上述所有五个挑战。该研究发表在《Stem Cell Reports》。
**研究方法概述**
研究人员开发并验证了一种基于hiPSC的二维（2D）共成熟方案，使小胶质细胞（iMGs）和Neurogenin-2（Ngn2）诱导的神经元（iNeurons）能够长期共同成熟。主要关键技术方法包括：(1) 利用hiPSC分化为造血祖细胞（HPCs），进而分化为iMGs，并优化了神经元相容性培养基以支持iMGs分化；(2) 采用Ngn2过表达诱导hiPSC快速分化为谷氨酸能神经元，并辅以胚胎第18天（E18）大鼠原代星形胶质细胞或hiPSC来源的星形胶质细胞（iAs）支持神经元成熟；(3) 通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫细胞化学（ICC）、流式细胞术、微电极阵列（MEA）记录和全细胞膜片钳电生理记录等多种技术，对共培养体系进行全面的转录组、蛋白表达、形态学和功能验证。研究使用了多个hiPSC细胞系（包括GM25256、AICS-0016 cl.18、HPSI0314i-hoik_1、HPSI0114i-kolf_2）以确保方案的可推广性。
**研究结果**
**定义用于小胶质细胞分化的神经元相容性培养基**
研究人员通过逐步优化，确定了一种简化且与神经元相容的培养基配方。该配方去除了原始McQuade培养基中的部分成分（如N2、NEAAs、MTG、ITS和胰岛素），保留了关键的小胶质细胞生长因子（IL-34、TGF-β、M-CSF），其余成分与Ngn2诱导神经元的培养基共享。此培养基能有效维持iMGs的细胞活力。
**神经元相容性培养基诱导小胶质细胞的基因、蛋白和功能特征**
通过转录组分析，研究人员发现，在神经元相容性培养基中分化的iMGs与原始培养基分化的iMGs以及原代人类小胶质细胞（PMGs）在转录组上聚类，远离未分化的hiPSCs，表明其成功获得了小胶质细胞样转录谱。关键小胶质细胞标记物（如CSF1R、TREM2、CX3CR1）在iMGs中表达，但稳态标记物P2RY12的表达低于体内PMGs，提示单一培养条件不足以完全诱导稳态小胶质细胞特征。流式细胞术和免疫细胞化学进一步证实了关键蛋白（如CD11b、CX3CR1、TMEM119）的表达，且两种培养基条件下的蛋白表达水平高度相似。功能实验（如吞噬pHrodo标记颗粒、对炎症刺激的蛋白分泌反应）验证了iMGs的功能性。
**星形胶质细胞是小胶质细胞长期存活和整合入神经元网络的必要条件**
在优化共培养方案时，研究人员发现星形胶质细胞至关重要。当培养体系中缺少星形胶质细胞时，小胶质细胞数量在培养第21天（DIV 21）后急剧下降，直至检测不到；而加入星形胶质细胞后，小胶质细胞数量从DIV 10至DIV 28保持稳定。流式细胞术和活/死细胞染色证实，缺乏星形胶质细胞导致小胶质细胞存活率降低和细胞死亡增加。此外，星形胶质细胞还促进了小胶质细胞在神经胶质网络中的整合（整合率从约10%提升至97%）。虽然缺乏星形胶质细胞时培养上清中谷氨酸水平升高，但药理性阻断谷氨酸转运体（EAATs）并未重现无星形胶质细胞条件下的细胞活力下降，表明星形胶质细胞的支持作用并非仅通过清除谷氨酸实现。
**共成熟方案诱导人类小胶质细胞的特征性形态、转录组和蛋白质表达**
与iMG单一培养相比，共培养体系中的iMGs表现出显著增强的分枝形态（ramification）。单细胞RNA-seq分析显示，两种培养条件下的iMGs转录组存在显著差异，其聚类结果截然不同。共培养iMGs中，与疾病相关小胶质细胞（DAM）特征相关的基因（如SPP1、APOE）显著下调，而与稳态和神经元重塑相关的基因集（如MPEG1、ITGB7）以及成体小胶质细胞特征基因上调。免疫细胞化学分析进一步证实，共培养iMGs中P2RY12和TMEM119的蛋白水平显著高于单一培养。
**共成熟培养体系呈现细胞类型特异性特征和具有有序突触活动的成熟神经元**
单细胞RNA-seq在DIV 28的共培养体系中鉴定出三类细胞：小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞。神经元簇表达突触标记物（如SYP、SYT1、SLC17A6），表明其已分化为兴奋性谷氨酸能神经元。免疫细胞化学证实了突触素1（Synapsin1）的表达。MEA记录显示，从DIV 14到DIV 28，神经元网络的自发放电活动（平均放电率）和网络同步化活动（网络爆发百分比）均随时间增加。全细胞膜片钳记录证实了功能性突触连接的存在，包括检测到微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）和光遗传学诱导的突触反应。
**共成熟培养体系呈现小胶质细胞-神经元串扰的关键特征**
免疫细胞化学图像提示iMGs与神经元轴突、突触后标记物Homer1以及轴突起始段（AIS）形成接触位点。活细胞成像显示小胶质细胞突起在神经胶质网络内持续快速运动并与神经元分支相互作用。基于单细胞RNA-seq数据的CellChat分析预测了iMGs与iNeurons之间的配体-受体相互作用，包括TGF-β、补体（C3）信号通路，以及L1CAM-(ITGA4+ITGB7)和APP-CD74等相互作用。
**hiPSC来源的星形胶质细胞与长期iMG-神经元共成熟方案兼容**
研究人员成功将方案扩展至使用hiPSC来源的星形胶质细胞（iAs），构建了全hiPSC来源的三细胞共培养体系。在DIV 28，仍可检测到GFP标记的iMGs，表明iAs能促进iMGs的整合和长期存活。MEA记录显示，全hiPSC三培养体系同样能支持神经元网络节律性活动的建立和发展。iMGs的分枝化程度从DIV 14到DIV 28逐渐增加，表明该方案也支持小胶质细胞特征的发育。
**总结与结论**
小胶质细胞对其周围环境高度敏感，这种环境依赖性的转录和功能特征使得其体外建模极具挑战性。为了应对这一挑战，研究人员开发了一种基于hiPSC的长期培养模型，其中小胶质细胞和神经元共同成熟。该方案提供了一个稳健、高效的平台，用于全面研究人类神经-免疫串扰。
研究人员得出结论：共成熟过程中持续的相互作用诱导了特征性的小胶质细胞-神经元相互作用，并改善了小胶质细胞在形态、基因和蛋白水平上的特征。hiPSC来源的神经胶质网络的存在导致了显著的小胶质细胞分枝化，并伴随着与神经元重塑和稳态小胶质细胞相关标记物的上调，突显了与CNS其他驻留细胞接触对于建立体外小胶质细胞身份的重要性。有趣的是，与单一培养相比，共培养中小胶质细胞中与神经退行性疾病病理相关的基因和信号通路（如APOE、SPP1）显著下调。这可能表明，来自神经元的健康信号缺失可能驱动了在阿尔茨海默病（AD）患者小胶质细胞和单一培养小胶质细胞中观察到的特征性疾病相关表型。这进一步表明，研究人员的共成熟模型可以减轻体外培养小胶质细胞通常引起的应激，这种应激通常会使其偏向于与神经退行性疾病相关的亚状态。因此，该共培养体系为研究小胶质细胞在各种情境下的作用提供了一个合适的平台。
在方案优化过程中，研究人员发现了星形胶质细胞对小胶质细胞存活和整合的根本作用。星形胶质细胞的支持功能可能不仅限于提供生长因子，也可能通过对神经元产生间接效应来介导。该方案还与hiPSC来源的星形胶质细胞方案相兼容，从而能够快速稳健地生成全hiPSC来源的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞三培养体系，这扩展了研究人类大脑功能的可能性。该2D格式增强了可扩展性，有利于进行活细胞成像、MEA和药物筛选等应用，同时保持了足够的复杂性来模拟细胞间相互作用和反映生理条件的表型。此外，该共成熟方法允许对小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的基因型进行完全控制，使其特别有助于解析具有已知遗传成分的疾病中细胞类型特异性贡献。研究人员改进的hiPSC来源小胶质细胞与神经胶质网络的共成熟模型，为研究健康和疾病状态下的神经-免疫串扰，特别是阐明小胶质细胞在调节神经元功能和发育中的作用，提供了一个强大的工具。
