评估陆生和水生无脊椎动物呼吸代谢的高通量呼吸测量技术的应用

《Journal of Insect Science》：Application of a high-throughput respirometry technique for assessing respiratory metabolism of terrestrial and aquatic invertebrates

　　

呼吸代谢是有机体的关键生态性状之一。正因如此，从宏观生态学研究到进化生物学等多个学科的生态学家都在对其进行研究，在全球变化的背景下，对其理解的需求变得更加迫切。然而，准确测量呼吸是一项耗时且成本高昂的工作，由于测量的难度，收集大型数据集可能会令人望而却步。在此，研究人员描述了一种基于荧光的高通量密闭系统呼吸测量技术，用于陆生和水生无脊椎动物，能够在2或4 ml的小瓶中并行测量多达240个通道的呼吸。研究人员使用了一种最初设计用于连续测量液体介质中实验室细胞培养物内氧气的装置来测量节肢动物的呼吸。通过一系列实验，研究人员证明了该系统在测量节肢动物呼吸方面的可靠性。即使是极小的节肢动物也能被测量，尽管果蝇必须以2到4只为一组进行测量。此外，该系统的模块化特性使其特别适合在短时间内评估呼吸代谢的完整热性能曲线。研究人员提供了有用的指南和R脚本，以利用该系统创建昆虫代谢的热性能曲线。

呼吸代谢率(有机体在静息状态下消耗氧气的速率)是进化生物学、群落动态和生态系统功能中常被测量的表型性状。物种内部的能量维持成本存在显著差异，且这种差异具有可重复性和遗传性。由于有限的能量预算在生长、繁殖和自我维持之间存在权衡，因此静息代谢率的变化对生活史性状和适合度具有重要意义。宏观生态学研究表明，代谢率的系统性变异与体重密切相关。生态学代谢理论提出，代谢率不仅随体重呈异速生长(生物体某特征随体型大小的变化规律)关系缩放，还遵循Boltzmann-Arrhenius关系随温度呈指数上升。在全球气候变暖背景下，物种对气候变暖的脆弱性与代谢的热性能密切相关。尽管已开发了流动式、间歇流式和密闭式等多种呼吸测量方法，但准确测量呼吸通常耗时且成本高昂，难以收集大型数据集。传统的密闭式呼吸测量系统仅能进行一次性测量，无法对同一有机体进行连续、重复的无损测量。

为解决上述瓶颈，研究人员开展了一项研究，将一种原本用于实验室细胞培养物O₂测量的高通量密闭系统呼吸测量技术改造并应用于陆生和水生无脊椎动物的呼吸代谢测量。该研究证明了该方法在测量小型节肢动物时的可靠性，并展示了其符合生态学代谢理论预期的质量和温度依赖性。这项研究的重要意义在于提供了一种能够并行测量多达240个样本的高效技术，使研究人员能够在极短时间内构建完整的呼吸代谢热性能曲线(描述生物体生理性能随温度变化的曲线)。该论文发表在《Journal of Insect Science》上，为全球气候变化背景下的生态学和进化生物学研究提供了强大的工具。

研究人员主要采用了基于荧光淬灭(荧光物质在特定分子存在下荧光强度降低的现象)原理的光学传感器技术，使用PreSens SDR SensorDish Reader进行非侵入性O₂检测。该系统可通过24通道读取器与扩展套件实现最多240个样本的并行测量。实验样本队列来源包括实验室饲养的果蝇和家蟋蟀，以及从野外捕获的多种陆生节肢动物和水生端足类，象甲则采集自半自然中宇宙设施。数据处理利用R软件进行线性混合模型和Sharpe-Schoolfield模型拟合，以计算代谢率、异速生长指数和质量校正后的热性能曲线。

Long-Term Stability and Repeatability of Respiration（呼吸的长期稳定性和可重复性）
通过对家蟋蟀的5小时长期稳定性实验和对火无翅红蝽的3天重复性实验，研究人员发现呼吸测量在不同时间和温度下均具有可重复性。在20°C下，由于孵化器温度随时间变化导致初始可重复性较低，但通过校正温度变化斜率或减去对照组斜率，可显著提高可重复性。这突出了在实验中设置空白对照以扣除背景呼吸和温度波动影响的重要性。此外，家蟋蟀的呼吸在30°C下随时间呈下降趋势，这可能是由于对高温的驯化反应或低氧引起的代谢下调。

Mass–Temperature–Respiration Relationships in Terrestrial and Aquatic Arthropods（陆生和水生节肢动物的质量-温度-呼吸关系）
通过对7种陆生节肢动物和水生端足类的测量，研究发现呼吸代谢依赖于体重，陆生节肢动物的异速生长指数α为0.48，去除带有钙化壳的蜗牛后α升至0.56；水生端足类的α为0.39。经质量校正后的陆生节肢动物呼吸随温度升高而增加，活化能E(启动化学反应所需的最低能量)为0.54，Q₁₀值为2.1。这些结果符合生态学代谢理论中关于质量和温度依赖性的预期。

Protocol for a Thermal Performance Curve of Respiration（呼吸热性能曲线协议）
以象甲为研究对象，通过在18至41°C范围内的11个温度点进行测量，研究人员成功构建了其呼吸代谢的热性能曲线。利用Sharpe-Schoolfield模型拟合得出活化能E为0.36，热最适温度T_opt为39.33°C，并观察到在热最适温度后呼吸急剧下降，证明了该系统能够完整捕捉代谢的响应。研究人员还提供了设计实验的指南和陷阱规避方法，例如合理选择温度序列、处理生物体积测量难度以及控制背景微生物呼吸等。

在讨论部分，研究人员总结道，该商业化系统经过微调后，能够可靠地测量各种小型陆生和水生节肢动物的呼吸代谢。所有结果与有氧代谢模型一致，其质量和温度代谢关系参数在无脊椎动物的正常范围内。虽然异速生长指数α略低于经典异速生长理论预期的0.75，但落入无脊椎动物的普遍分布范围内。活化能E也接近好氧呼吸的常见范围。该系统的高并行化和模块化特性使得在短时间内收集大型数据集和构建完整热性能曲线成为可能。对于极小物种如单只果蝇，虽存在信号过低问题，但通过小规模群体测量可有效解决。在水生环境中，背景微生物的呼吸可能干扰结果，特别是在高温下细菌繁殖加速，因此建议进行空白试验校正或测量后重新评估水体基线呼吸。研究结论强调，这项技术将使得收集关于节肢动物呼吸代谢的密集数据成为可能，从而为解答全球气候变化背景下的紧迫生态和进化问题提供关键支持。