基于COBRA的蛋白疫苗经鼻内递送并辅以c-di-AMP佐剂增强对季节性流感病毒的保护性免疫应答的广度

《Frontiers in Immunology》：Intranasal delivery of a COBRA-based protein vaccine adjuvanted with c-di-AMP enhances breadth of protective immune responses against seasonal influenza viruses

　　

季节性流感疫苗对抗原漂移的甲型流感（H1N1和H3N2）和乙型流感病毒提供可变保护。采用计算优化广谱反应抗原（COBRA）的广谱保护方法可增强针对多种毒株的免疫力。双-(3′,5′)-环状二腺苷酸一磷酸（c-di-AMP）是一种黏膜佐剂，可增强疫苗诱导的免疫应答。在此，研究人员假设鼻内多价COBRA血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）疫苗与c-di-AMP联合使用可在小鼠中诱导广泛的体液和细胞免疫。将免疫学初始和预免疫DBA/2J小鼠经鼻内免疫接种含有COBRA重组HA和NA或相应野生型抗原的五价疫苗制剂。以低或高抗原剂量给药，加或不加黏膜佐剂c-di-AMP。评估了体液和细胞免疫应答，以及甲型流感（H1N1和H3N2）和乙型流感病毒攻毒后的保护作用。五价COBRA HA/NA鼻内疫苗接种联合c-di-AMP佐剂在小鼠模型中诱导了强烈的体液和细胞免疫应答。疫苗接种在预免疫小鼠中诱导了稳健的、剂量依赖性的总IgG和血凝抑制（HAI）滴度，以及高频率的抗原特异性抗体分泌细胞和干扰素-γ（IFN-γ）产生细胞。初始小鼠在高疫苗剂量下也主要针对H1N1获得了血清保护。在H1N1、H3N2和乙型流感病毒致死性攻毒后，接种疫苗的小鼠体重减轻减少、肺病毒滴度降低、生存率提高，在初始和预免疫模型中，佐剂组均观察到最强的保护。这些发现强调了将广谱保护性COBRA候选疫苗与先进黏膜佐剂相结合以增强针对抗原漂移流感病毒株效力的价值。

**论文解读文章**

**研究背景、问题与目的**
季节性流感疫苗对甲型（H1N1、H3N2）和乙型流感病毒的保护效力有限（30%–60%），主要由于疫苗株与流行株之间的抗原漂移频繁导致匹配不良。传统疫苗主要诱导针对可变血凝素（HA）头部结构域的株特异性抗体，难以应对病毒持续变异。为克服这一局限，研究人员开发了基于计算优化广谱反应抗原（COBRA）的免疫原，通过多层共识序列比对整合HA和神经氨酸酶（NA）中的保守表位，以诱导更广谱的免疫应答。此外，黏膜佐剂如双-(3′,5′)-环状二腺苷酸一磷酸（c-di-AMP）可通过激活干扰素基因刺激因子（STING）通路增强体液和细胞免疫记忆。本研究旨在评估鼻内递送五价COBRA HA/NA疫苗联合c-di-AMP佐剂在免疫学初始和预免疫小鼠模型中的免疫原性和保护效力，并探讨抗原剂量、佐剂及预存免疫对疫苗效果的影响。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。

**主要技术方法**
研究人员使用DBA/2J雌性小鼠（6–8周龄，购自Jackson Laboratory），分为初始和预免疫两组。预免疫小鼠先经鼻内感染历史流感病毒株（H1N1 SG/86、H3N2 PN/99、IBV HK/01）以建立免疫记忆。疫苗抗原包括五价COBRA重组HA（Y2、NG7、BC17）和NA（N1I、N2B）及相应野生型（WT）抗原（CA/09、HK/14、PH/13等）。以0.1或1 μg/抗原经鼻内免疫两次（第0、28天），加或不加5 μg c-di-AMP佐剂。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清总IgG及亚类，血凝抑制（HAI）试验评估对多种H1N1、H3N2和乙型流感病毒株的抗体广度，酶联免疫斑点（ELISpot）检测脾脏中抗原特异性抗体分泌细胞（ASC）及IFN-γ/IL-17分泌细胞，最后用致死剂量病毒（H1N1 BR/18、H3N2 SW/13、IBV WA/19）攻毒，监测体重、存活率及肺病毒滴度。

**研究结果**

**3.1 五价COBRA rHA和rNA疫苗联合c-di-AMP佐剂诱导系统性流感特异性IgG滴度**
通过ELISA检测预免疫小鼠血清中针对COBRA和WT HA/NA蛋白的IgG水平。结果表明，接受1 μg五价COBRA联合c-di-AMP佐剂的小鼠在所有测试抗原（Y2、NG7、BC17、N1I、N2B）上均具有最高的IgG滴度和曲线下面积（AUC），且呈剂量依赖性。佐剂组IgG1:IgG2a比值更平衡（Th1/Th2混合型），而未佐剂组则以IgG1为主（比值>4.5）。

**3.2 五价HA和NA疫苗联合c-di-AMP佐剂诱导保护性H1N1、H3N2和IBV HAI滴度**
对初始和预免疫小鼠的血清进行HAI试验。初始小鼠中，高剂量（1 μg）COBRA+佐剂组对三种H1N1毒株（BR/18、GD/19、VC/19）产生保护性HAI滴度（≥1:80），但对H3N2和IBV滴度较低或无。预免疫小鼠中，高剂量COBRA+佐剂组对H1N1、H3N2及IBV均产生显著更高的HAI滴度，且低剂量佐剂组也能对H1N1和部分IBV提供保护。佐剂显著增强了抗体广度，尤其在预免疫背景下。

**3.3 五价rHA/rNA疫苗在预免疫小鼠中诱导强效抗体分泌细胞**
预免疫小鼠接种高剂量（1 μg）疫苗后，脾脏中检测到针对HA和NA的抗原特异性ASC。所有COBRA和WT疫苗组均诱导了约250–1000 ASC/百万脾细胞。对于H1 HA，COBRA+佐剂组ASC数量较未佐剂组增加约1.5倍，而对H3、IBV、N1、N2的ASC数量在佐剂组与未佐剂组间相似，提示佐剂对H1特异性ASC的招募作用更显著。

**3.4 佐剂HA/NA疫苗诱导比未佐剂疫苗更高频率的IFN-γ和IL-17分泌抗原特异性脾细胞**
通过ELISpot检测预免疫小鼠脾细胞中流感特异性T细胞应答。COBRA+佐剂组对H1、H3、IBV、N2肽池刺激的IFN-γ分泌细胞频率均高于未佐剂组，如对H1肽池达到880 SFU/10⁶细胞，而对N2肽池为1350 SFU。IL-17分泌细胞方面，COBRA+佐剂组对H3和N2肽池产生较高频率，但对H1和IBV肽池低于WT+佐剂组，可能与COBRA抗原与WT肽库的T细胞表位差异有关。未佐剂疫苗几乎不诱导T细胞应答。

**3.5 基于COBRA的疫苗联合c-di-AMP佐剂保护小鼠抵抗致死性流感病毒攻毒**
初始和预免疫小鼠于攻毒后监测12天。初始小鼠中，高剂量COBRA+佐剂组对H1N1攻毒完全保护（100%存活），体重减轻<7%，肺病毒滴度检测不到；对H3N2攻毒，高剂量佐剂组（COBRA或WT）全部存活，体重减轻约10%，肺病毒滴度>10³ PFU/g；对IBV攻毒，高剂量COBRA+佐剂组80%存活，肺病毒滴度降至10⁵ PFU/g，显著低于其他组。预免疫小鼠中，所有接种疫苗组（包括未佐剂高剂量COBRA）对H1N1和H3N2攻毒均100%存活，但佐剂组体重减轻更少（<2%），且肺病毒滴度更低。未佐剂低剂量组对H3N2保护不完全。预免疫小鼠对IBV攻毒各组均存活，但仅佐剂低剂量组有可检测病毒滴度。总体而言，佐剂增强了保护效果，尤其在初始小鼠中。

**讨论与结论**
讨论部分指出，c-di-AMP佐剂将免疫应答导向更平衡的Th1/Th2/Th17谱型，而未佐剂疫苗偏向Th2。在初始小鼠中，佐剂使低剂量COBRA疫苗也能诱导保护性HAI滴度，体现了抗原节省效应。预免疫小鼠中，COBRA抗原本身即可诱导强效B细胞回忆应答，但佐剂进一步增强了IFN-γ产生细胞频率，有助于病毒清除。攻毒结果证实，佐剂联合高剂量疫苗提供最全面的保护，包括完全存活和肺病毒复制显著抑制。研究局限性在于未直接评估呼吸道黏膜免疫（如IgA和组织驻留记忆细胞），未来需进一步探究。结论部分翻译如下：综合分析，这些发现表明，这种无针鼻内递送的五价COBRA HA/NA疫苗平台联合c-di-AMP佐剂以剂量依赖性方式拓宽了对季节性甲型和乙型流感病毒的体液和细胞免疫。免疫应答增强了跨亚型保护，限制了病毒复制，并减轻了初始和预免疫小鼠的疾病严重程度。这些疫苗策略可能适用于保护免受多种流感病毒亚型感染，并具有减少不同免疫背景下的株间不匹配的潜力。进一步优化该策略可能实现对当前和新兴流感病毒的交叉保护性免疫。