基于荧光门控流式细胞术检测哺乳动物细胞中脂质翻转酶活性的方法

《The Journal of Membrane Biology》：Fluorescence-Gated Flow Cytometry Approach for Measuring Lipid Flippase Activity in Mammalian Cells

　　

P4-ATPase脂质翻转酶（lipid flippases）维持真核细胞膜双层脂质的跨膜不对称性，越来越多证据表明互作伴侣参与调控翻转酶活性。然而，在哺乳动物细胞中评估互作依赖的翻转酶活性的影响，受异质性蛋白表达与背景脂质转运的干扰而十分复杂。研究人员在此提出一种基于表达的门控策略，用于细胞内NBD-脂质摄取检测，在瞬时表达条件下提升了灵敏度与可解释性。利用该方法，研究人员考察了推定的互作蛋白VAMP3与TMEM230对人类ATP11C转运磷脂酰丝氨酸（PS）能力的影响。VAMP3对NBD-PS摄取无 detectable 效应，而TMEM230表现出强抑制表型。该基于表达的策略提高了ATP11C变体间的分辨力，并大幅减少了可靠分析所需事件数。上述进展为系统性、基于细胞的哺乳动物P4-ATPase功能调控互作研究提供了框架。

研究背景方面，真核细胞膜脂质双层的不对称分布由 scramblases、floppases 与 flippases 共同维持，其中 P4-ATPase 脂质翻转酶（lipid flippases）以 ATP 依赖方式将脂质从胞外侧转运至胞质侧，多数与 CDC50 家族β亚基形成异二聚体发挥功能。ATP11C 等成员突变与先天性溶血性贫血等疾病相关，其活性受磷酸化、剪切及磷脂酰肌醇等调控，近期蛋白组学提示 VAMP3、TMEM230 可能为 ATP11C/ATP9A 互作伙伴，但生理相关性未明。传统 NBD-脂质摄取流式检测在瞬时转染下因非表达细胞背景摄取高、门控混淆、需大事件数，难以系统评估互作调控。为此，研究人员建立基于荧光蛋白标签的表达门控流式策略，在 HeLa-CDC50A 稳转细胞中以 ATP11C-mCherry 为模型，联用 BFP 标签互作蛋白，实现表达细胞选择性分析与共表达亚群分离，以厘清 VAMP3 与 TMEM230 对 ATP11C 介导 PS 翻转的调控。

关键技术方法上，研究人员采用稳转 CDC50A 的 HeLa 细胞系（HeLa-CDC50A）作为表达背景；将 ATP11C 及催化失活变体 ATP11C^E181Q C 端融合 mCherry，候选互作蛋白 VAMP3、TMEM230 N 端融合 BFP，经 PEI 瞬时共转染；15 °C 下以 1 μM NBD-PS 孵育 20 分钟，脂肪酸游离 BSA 回抽未转运探针，DRAQ7 排除死细胞；NovoCyte 四激光流式采集，FlowJo 中以 FSC/SSC 去碎片、单峰门控后，依 mCherry 单阳门或 mCherry+BFP 双阳门（Q2）提取事件，以门内 NBD-A 中位荧光强度为摄取读数，并可归一化至 mCherry 表达量；通过时序下采样评估最低事件数。

研究结果部分，小标题“Fluorescent Protein Tags Improve the Selection of Positive Events”下，研究人员比对经典 NBD 阳门、DRAQ7 阴门与 mCherry 表达门，发现表达门将 ATP11C 与 ATP11C^E181Q 区分倍率由 1.3–1.4 提升至 1.6 倍，回溯显示经典门含 35% 非表达细胞、DRAQ7 门含 61% 非表达细胞；时序下采样表明 2000–3000 事件（约 T3）后中位 NBD 荧光即稳定，故后续取 2500–10000 事件即可。小标题“Expression-Based Double Gating Isolates Co-expressors for Interactor Analysis”下，BFP-VAMP3 与 BFP-TMEM230 转染效率约 43–49%，与 ATP11C-mCherry 共转后双阳 Q2 亚群占全细胞约 20–22%，证明双门可锁定共表达群体。小标题“ATP11C-Mediated NBD-PS Uptake is Inhibited by TMEM230 but Unaffected by VAMP3”下，VAMP3 共表达对 ATP11C 依赖的 NBD-PS 摄取无影响，归一化至 mCherry 后亦然；TMEM230 共表达使摄取降低 6.7 倍，单表达 TMEM230 亦抑内源背景摄取，归一化后抑制仍显著，故 TMEM230 是 ATP11C 介导脂质转运的抑制调节子。

讨论与结论翻译部分，研究人员指出表达门控通过剔除非表达细胞背景提升弱活性变体分辨力，双门实现互作共表达选择性分析，下采样降低事件需求使瞬时筛选可行；VAMP3 无端点效应不代表其他时空无调控，TMEM230 抑制可能源于直接互作、膜定位改变或内体 trafficking 干扰，需共聚焦共定位与表面丰度实验厘清；方法局限含标签可能影响定位、端点读数不反映动力学、15 °C 残存内吞未完全排除。研究结论为：该表达门控 NBD-脂质摄取流式框架在瞬时转染下可靠读取翻转酶及其互作调控，TMEM230 抑制 ATP11C 介导与基础 PS 摄取，VAMP3 本系统中无 detectable 影响，该平台可扩展至 P4-ATPase 家族调控互作与活细胞翻转酶生物学研究。论文发表于《The Journal of Membrane Biology》。