《Frontiers in Immunology》：Targeting angiogenesis: advances in the design and engineered applications of nanobodies
血管生成是一个基本的生理过程；然而，其病理性的失调可驱动多种疾病，例如实体瘤、湿性年龄相关性黄斑变性和类风湿关节炎。尽管常规抗血管生成单克隆抗体在临床上有效，但其受到组织穿透性差、脱靶毒性以及对代偿性耐药易感性的限制。本综述系统地考察了靶向血管生成相关通路的纳米抗体（nanobodies，Nbs）的结构优势和工程策略。先进的工程方法，如人工智能辅助的人源化和多价组装，可有效减轻免疫原性并延长血清半衰期。此外，多特异性设计能够同时阻断代偿通路以规避耐药。同时，临床前研究表明，将这些分子整合到特定位点纳米抗体-药物偶联物（nanobody-drug conjugates，NDCs）和靶向递送载体中，可能提高治疗精确性和局部药物蓄积；然而，其长期安全性、可制造性和临床获益仍有待证实。用放射性核素或荧光团功能化纳米抗体，可能促进新型诊疗一体化平台的开发，从而支持实时分子成像和图像引导手术。与此同时，基于纳米抗体的CAR-T（Nb-CAR-T）细胞能够促进疾病微环境的重塑。最终，本综述强调了工程化纳米抗体作为一种高度可编程且具有变革性的平台的价值。通过克服传统抗体的关键局限性，工程化纳米抗体为实体瘤的精准、多维干预开辟了新途径。其在某些非肿瘤性血管生成疾病中的潜力正在显现，但仍需进一步验证。
1 引言
血管生成是从现有血管系统中形成新生血管的过程，是维持机体稳态和组织修复的关键机制。虽然这一过程对于胚胎发育、组织生长和伤口愈合等生物学事件不可或缺，但其需要严格的时空调控。持续异常的血管生成激活是多种血管生成依赖性疾病的共同驱动因素，包括实体瘤、湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）、糖尿病黄斑水肿（DME）和类风湿关节炎。抗血管生成治疗已成为过去三十年来药物研发的热点。以贝伐珠单抗和西妥昔单抗为代表的传统单克隆抗体凭借高特异性和强中和能力取得了显著的临床成功。然而，这些药物存在若干临床局限性：其大分子量（约150 kDa）严重限制了对实体瘤的穿透；此外，Fc段介导的效应功能和较长的血清半衰期增加了脱靶毒性和免疫原性的风险；单靶点阻断常诱导代偿性旁路激活，最终导致获得性耐药。因此，开发兼具高亲和力、优异组织穿透性和低免疫原性的新型抗血管生成治疗药物仍是迫切的临床需求。
来源于骆驼科重链抗体的纳米抗体，凭借其高溶解性和模块化特性，已成为下一代靶向治疗的有前景的候选分子。尽管尺寸紧凑，其仍保留完整的抗原结合能力，同时表现出优异的组织穿透性、快速肾脏清除和稳健的稳定性。这些特性使其能够克服传统单克隆抗体的固有局限性，如递送效率低和免疫原性高，凸显了其临床转化的巨大潜力。本综述系统考察了抗血管生成纳米抗体的工程策略及其转化应用，重点介绍了人源化、多价和多特异性设计、靶向药物递送及诊疗一体化平台的最新进展，并讨论了当前挑战和未来前景。
2 纳米抗体的结构和性质
除常规异四聚体抗体外，骆驼科动物还拥有一类独特的血清抗体，称为重链抗体（HCAbs），这是一种天然缺乏轻链的免疫球蛋白G（IgG）。在该同源二聚蛋白的N端区域，重链含有一个专用可变结构域，即重链抗体的可变重链结构域（VHH），其在结构和功能上等同于常规抗体的抗原结合片段（Fab）。VHH的分子量通常为12–15 kDa，尺寸约为4 × 2.5 × 3 nm；同时，其紧凑结构使得能够进行合理的尺寸工程，范围从单体纳米尺度到多价构建体或偶联治疗载荷时的10 nm以上。结构上，VHH包含四个保守框架区（FR1–FR4）和三个互补决定区（CDR1-3）。为弥补缺乏可变轻链（VL），VHH的CDR3显著延长（16–18个残基），形成可深入抗原裂隙或隐蔽表位的“指状”突起结构。此外，将FR2区关键疏水残基替换为亲水性残基，显著提高了溶解度并防止聚集。VHH还常含有额外二硫键，增强构象稳定性和刚性。因此，VHH表现出优于全长IgG和传统抗体片段（如scFv和Fab）的诸多优势：高热稳定性、宽pH耐受性、高溶解性和低聚集倾向，便于长期储存和给药；小尺寸增强了对致密组织如实体瘤的穿透，而缺乏Fc结构域则降低了免疫原性。通过文库构建和展示筛选，可分离出具有特异性抗原结合活性的VHH，这些重组蛋白因其纳米级尺寸而广泛称为纳米抗体（Nbs）。
VHH的这些特性赋予纳米抗体高度模块化的结构，便于实施各种工程策略。例如，可利用柔性连接头轻松生成多价或双特异性构建体；还可通过融合效应分子如药物、治疗性蛋白或成像剂来扩展其功能。这些模块化设计极大简化了多功能分子的组装，促进了其在疾病诊断、靶向治疗和药物递送中的广泛应用。
3 肿瘤微环境中的血管生成与免疫调节
3.1 血管生成机制和分子靶点
血管生成的调控涉及高度复杂的信号通路网络。VEGF/VEGFR轴是血管生成的主要驱动因素，激活下游级联如PI3K/AKT和MAPK/细胞外信号调节激酶（ERK），促进内皮细胞增殖、迁移、管形成和血管通透性。同时，血管生成素-2/Tie2（Ang2/Tie2）和Notch/DLL4通路调控血管成熟并维持有序分支。此外，PDGF/PDGFR、FGF/FGFR和HGF/c-Met通路对周细胞募集、内皮细胞存活以及VEGF阻断后的代偿信号至关重要。在缺氧条件下，HIF-1α介导的转录网络上调多种促血管生成因子，作为该过程的关键微环境调节因子。
这些通路相关的多种生物分子——主要是促血管生成因子、细胞黏附分子和微环境调节因子——是纳米抗体开发的关键靶点。其中，促血管生成因子如VEGF、FGF、血管生成素、HGF及其受体是当前纳米抗体研究的重点。作为胞外蛋白或膜结合受体，这些靶点易于被纳米抗体结合，从而高效阻断下游信号级联。靶向细胞黏附分子（如整合素和钙黏蛋白）和微环境调节因子（如基质金属蛋白酶和HIF-1α）的纳米抗体还可提供临床诊断双重优势，可与抗血管生成疗法联合使用以增强疗效并减轻耐药，同时作为实时成像和精确评估血管生成的新型分子工具。
3.2 血管生成驱动的肿瘤微环境免疫逃逸
病理性血管生成本质上驱动肿瘤微环境（TME）内的免疫逃逸。促血管生成因子（主要是VEGF）的过表达创造了免疫抑制环境，阻碍抗肿瘤免疫。VEGF阻碍树突状细胞（DC）成熟和抗原呈递，削弱适应性免疫应答的启动。结构紊乱且渗漏的肿瘤血管产生局部缺氧，招募并极化先天免疫细胞向抑制表型发展，特别是M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞随后分泌更多促血管生成因子，形成正反馈循环，加剧血管异常和免疫抑制。在淋巴区室中，病理性血管生成扰乱淋巴细胞浸润和效应功能。肿瘤内皮细胞常下调关键黏附分子，形成“内皮屏障”，限制细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和自然杀伤（NK）细胞向肿瘤核心外渗。相反，失调的血管信号和缺氧优先促进调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）的募集和存活，进一步抑制CTL和NK细胞激活，最终确保免疫耐受并驱动肿瘤进展。
纳米抗体凭借独特的结构和药理学特性，可有利地重塑免疫抑制性肿瘤微环境以增强癌症免疫治疗。通过精确中和关键促血管生成轴（如VEGF或Ang-2），抗血管生成纳米抗体可诱导短暂血管正常化，恢复内皮连接的结构完整性，减少血管渗漏并缓解局部缺氧。血管正常化通过上调关键黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1）克服内皮屏障限制，从而促进CTL和NK细胞从外周循环向肿瘤实质的大量浸润。
3.3 抗血管生成治疗耐药机制
对抗血管生成治疗的耐药不仅涉及替代促血管生成通路的代偿性激活。肿瘤可能通过血管共存维持其血液供应，即肿瘤细胞浸润周围组织并利用宿主既有血管而不诱导内皮出芽。血管生成拟态提供了另一种VEGF非依赖机制，高可塑性肿瘤细胞获得内皮样特性并形成可灌注的血管样通道。肿瘤相关内皮细胞也可能经历表型重编程，包括内皮-间质转化，导致血管生成受体表达改变并降低对VEGF/VEGFR信号的依赖。这些替代性血管化机制和细胞转变可在有效抑制经典血管生成的情况下维持肿瘤灌注。
抗血管生成治疗还可能加剧缺氧和营养剥夺，从而通过增强糖酵解、乳酸利用、线粒体重编程以及激活细胞应激反应通路促进代谢适应。治疗诱导的缺氧可进一步募集肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞和其他免疫抑制群体，这些细胞分泌替代性血管生成介质并抑制抗肿瘤免疫。这些耐药机制可能在治疗过程中共存并动态演变，表明仅通过VEGF阻断难以实现持久的血管控制。其机制多样性因此支持开发耐药信息指导的纳米抗体工程策略和基于机制的联合疗法。
4 靶向血管生成的纳米抗体工程
尽管具有固有的结构和生化优势，纳米抗体在实际生物医学应用中仍面临若干限制。首先，其低分子量远低于肾小球滤过阈值（50–60 kDa），导致血清半衰期短，阻碍临床转化。其次，单价纳米抗体靶点亲和力较低，且缺乏Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC），限制了其对抗复杂疾病的效力。同时，基于纳米抗体的多特异性工程策略正成为克服实体瘤治疗瓶颈的关键方法。通过整合针对血管生成和免疫检查点（ICs）的双靶向模块，这些构建体实现机制互补和协同。具体而言，抗血管生成组分诱导肿瘤血管正常化，纠正异常病理血管，并通过减弱缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）介导的免疫抑制细胞募集和激活来逆转缺氧驱动的免疫抑制；ICs模块直接靶向抑制性检查点（如PD-1/PD-L1），恢复耗竭T细胞（Tex）的效应功能。这种双重策略破坏物理血管屏障并阻断分子检查点通路，从而高效地将免疫学“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。最后，骆驼源序列仍保留引发免疫应答的潜在风险。因此，工程化修饰对于将这些生物分子转化为可行的临床治疗药物至关重要。
4.1 人源化
VHH与人抗体可变区具有80%–90%的序列同源性，因此其免疫原性低于传统异源抗体。然而，血管生成依赖性疾病如实体瘤和自身免疫病的治疗通常需要数月或数年的慢性重复给药，增加了抗药抗体（ADA）产生的风险。临床数据显示某些纳米抗体项目中ADA发生率超过30%。因此，人源化对于减轻潜在免疫原性至关重要。
互补决定区（CDR）移植涉及将VHH CDR转移到人模板框架上。Vincke等人引入了通用人源化纳米抗体框架NbBCII10FGLA，有效保留了VHH稳定性和抗原结合能力。另一种更保守的策略称为表面重塑，通过分析VHH溶剂可及性，仅替换溶剂暴露的框架残基，同时保留埋藏残基和CDR。Kazemi等人将此技术应用于VEGF靶向纳米抗体Nb42的表面残基替换，工程变体与野生型Nb42无显著结构偏差，保留相当的ELISA结合和VEGF抑制功能，且T细胞表位预测显示免疫原性降低。在通用NbBCII10FGLA模板基础上，Gonzalez等人构建了全合成人源化VHH文库，从中筛选的NbH1变体表现出改善的溶解度、热稳定性和对VEGF的纳摩尔亲和力。然而，CDR移植依赖框架区仅为惰性支架的假设，忽视了框架残基在VHH抗原结合位点中的关键作用。与传统抗体不同，VHH可能利用FR2区残基进行抗原接触。此外，表面重塑虽假定保留非人框架可维持溶解度，但支撑纳米抗体溶解性的FR2标志本身即为表面暴露且非人源。许多研究的验证仅限于基于ELISA的亲和力测定，人源化突变是否微妙地破坏涉及框架残基的构象表位或损害溶解度、聚集倾向等关键理化性质仍未解决。
近期，抗体序列和结构数据的快速积累使计算辅助和AI驱动方法成为平衡序列“人源化”和“自然性”的核心策略。Sang等人开发了Llamanade，首个专用于纳米抗体的开源人源化工具，通过大规模序列比对识别VHH特异性特征，优先保留高度保守的FR2残基和CDR3相关位点，实现对框架表面重塑的精确控制。Ramon等人开发的AbNatiV采用向量量化变分自编码器（VQ-VAE）深度学习框架，准确定量序列的自然性和人源化参数，直接指导精确框架突变，特别是FR2标志残基。随着AlphaFold等结构预测模型与人源化算法日益整合，未来流程可能直接从靶标表位生成临床级人源化纳米抗体，显著加速抗体药物发现。
尽管这些计算工具较传统手动移植有明显进步，其验证方法仍有显著局限性。多数研究主要依赖计算机模拟的人源化评分和体外结合实验。这些人源化指标与实际临床免疫原性之间的相关性较弱。此外，过度强调“人源化”最大化常常与其他关键可开发性特性产生权衡，特别是抗血管生成应用。例如，为减少T细胞表位引入的突变可能无意中增加表面疏水性或破坏多价、双特异性构建所需界面。AI模型训练和基准测试数据集的偏差也是进一步限制：公共抗体库中常规人IgG序列数量远超骆驼VHH条目，可用的纳米抗体数据集对骆驼物种多样性、种系家族、免疫方案、抗原类型和实验平台的代表性不足。由于VHH种系基因使用决定CDR3构象、框架-部分位点相互作用和生物物理稳定性，在偏斜库上训练的模型可能学习谱系特异性序列偏差，导致在代表性不足的VHH家族或非常规表位拓扑上性能下降。未来AI流程应实现来源感知去重，并基于种系分类和抗原聚类强制执行数据分割，同时进行严格的外部验证。
4.2 多价/多特异性组装
尽管单价纳米抗体具有优异的组织穿透性和稳定性，其治疗实用性常受低结合亲和力、短血清半衰期以及无法同时阻断协同信号通路的限制，最终导致耐药或疗效不足。因此，通过多价和多特异性组装工程化纳米抗体已成为增强抗血管生成效力的关键策略。
该方法主要涉及使用柔性或刚性连接头串联融合相同或不同VHH结构域以生成新型融合蛋白。例如，Sadeghi等人构建的双价抗VEGF纳米抗体显著增强了对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、管形成和迁移的抑制，同时将血浆半衰期延长约1.8倍。Huang等人进一步优化连接头构建四价抗VEGF纳米抗体，其结合亲和力较单价形式提高134倍，阻断VEGF-VEGFR信号的能力增强约6倍。此外，通过模块化融合不同VHH结构域实现的多特异性工程允许同时阻断多条信号通路，从而克服单靶点治疗的局限性。例如，肿瘤在VEGF阻断后常通过Ang-2/Tie2或DLL4/Notch通路旁路激活实现血管生成代偿，共靶向VEGF与Ang-2或DLL4可有效中和这些代偿机制。多特异性组装还促进了血管生成抑制与免疫调节之间的协同效应。Eskafi等人设计了抗VEGF/抗程序性死亡配体1（PD-L1）双特异性纳米抗体，该分子协同抑制HUVEC和肿瘤细胞增殖及管形成，同时阻断PD-L1介导的T细胞抑制，实现抗血管生成和免疫检查点阻断的双重效果。此外，多特异性构建体常被用于延长半衰期，通过掺入人血清白蛋白（HSA）结合结构域延长体内循环时间。例如，BI 836880融合抗VEGF、抗Ang-2和HSA结合结构域，在多种患者来源异种移植模型中表现出优于单靶点抑制的抗增殖和抗血管生成活性，血浆半衰期长达11天。
然而，多价或多特异性构建体可能带有某些固有风险。尽管融合HSA结合结构域有效缓解了纳米抗体固有的快速肾脏清除，但由此增加的分子量可能削弱纳米抗体相对于传统抗体的组织穿透优势。此外，大型组装体的结构完整性对pH和温度敏感，一个结构域的轻微错误折叠可能暴露疏水斑块，在慢性给药方案下提高聚集和免疫原性风险。对64种TNF靶向构建体的系统比较表明，双特异性和串联scFv形式在聚集、片段化和界面应力测定中始终比天然IgG积累更多风险，其中scFv-scFv和双抗体形式风险最高。片段化主要归因于甘氨酸-丝氨酸（GS）连接头，表明连接头工程（如长度调节、二硫键稳定）是必要设计步骤。此外，对单价IgG或纳米抗体表现良好的计算机模拟工具往往无法解决这些工程构建体的格式特异性风险。另一方面，许多血管生成靶点也存在于正常血管上，阻断它们可能引起严重副作用。尽管共靶向VEGF和DLL4/Notch在机制上具有抑制代偿性血管生成的吸引力，但demcizumab的临床经验报告了28%患者出现III级高血压、肺动脉高压以及肝窦内皮细胞损伤的类别效应。近期研究采用AI驱动设计框架整合AlphaFold2和RFdiffusion等结构预测算法来阐明抗原表位与VHH CDR之间的空间互补性。然而，AlphaFold2常无法准确预测长连接头的构象动力学或人源化过程中框架突变的结构后果，且AI虽可优化计算机模拟稳定性，尚不能可靠预测体内药代动力学相互作用或多结构域构建体的累积免疫原性。因此，计算设计虽可指导多价纳米抗体的初始草拟，严格的实证验证对于在临床入组前降低这些复杂模式的风险仍不可替代。
4.3 基于纳米抗体的功能化药物载体
由于缺乏特异性，常规化疗药物常诱导严重全身副作用。因此，通过血管生成相关靶点的特异性识别实现抗肿瘤药物的靶向递送已成为突出研究热点。在这些靶向系统中，纳米抗体作为精准模块赋予药物分子细胞、基质或微环境特异性。目前，已开发多种利用纳米抗体进行药物递送的灵活策略，大致可分为纳米抗体-药物偶联物（NDCs）和基于纳米抗体的药物递送载体（NDVs）。
4.3.1 纳米抗体-药物偶联物（NDC）
尽管抗体-药物偶联物已取得显著临床成功，传统单克隆抗体的大分子量限制了其更广泛应用。NDCs正迅速成为有前景的替代方案。由于结构简单和分子量低，纳米抗体在药物偶联方面具有独特优势，包括：缺乏Fc结构域和糖基化，确保更均匀的生产和更优的质量控制；小尺寸便于位点特异性偶联并增强实体瘤穿透；与微生物表达系统的兼容性提高产量同时降低生产成本和时间；更易于工程化多靶向偶联物。
NDC由纳米抗体与治疗载荷连接组成，偶联策略是其设计核心。蛋白类载荷通常采用基因融合，小分子化疗药物则通过化学偶联共价连接。化学连接大致分为随机偶联和位点特异性偶联。随机偶联依赖赖氨酸胺基或半胱氨酸巯基与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯或马来酰亚胺反应，虽直接但常产生异质性的药物-抗体比（DAR），且修饰CDR内赖氨酸残基可能损害靶点结合活性。因此，位点特异性偶联已成为首选策略，常用方法包括C端工程半胱氨酸偶联、分选酶A介导偶联和非天然氨基酸掺入技术。尽管这些技术存在特定挑战，但能实现选择性修饰特定氨基酸序列，精确控制DAR。
2013年，Behdani等人开创了靶向血管生成的纳米抗体-药物偶联物设计，筛选并分离出特异性抗VEGFR2纳米抗体3VGR19，与截短的铜绿假单胞菌外毒素A融合，体外选择性抑制VEGFR2阳性细胞增殖。随后，该团队通过sulfo-SMCC连接头将抗VEGFR2纳米抗体与白喉毒素片段化学偶联，所得VGRNb-DT免疫毒素在前列腺癌PC-3细胞系中表现出良好治疗效果。尽管临床前进展令人鼓舞，NDC的治疗转化受其最小架构固有的药代动力学缺陷阻碍：快速肾脏清除和代谢不稳定性。虽然PEG化等策略已被用于延长NDC的系统暴露，但同时增加了流体力学体积，造成增强循环保留以牺牲肿瘤穿透性为代价的药效学悖论。
4.3.2 基于纳米抗体的药物递送载体（NDV）
基于纳米抗体的药物递送载体代表纳米抗体工程的另一个关键方向。与直接偶联的NDC不同，NDV利用纳米抗体作为靶向配体修饰脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物或无机纳米颗粒等载体表面。实体瘤通常具有高通透性血管且缺乏功能性淋巴引流，产生增强通透性和保留（EPR）效应，允许大分子和纳米颗粒优先蓄积。NDV利用这一病理生理特征，结合EPR效应与表面展示纳米抗体介导的主动靶向，实现高药物载荷、延长循环和特异性外渗至肿瘤血管或新生血管微环境。血管生成相关靶点如VEGF/VEGFR和EGFR在NDV研究中高度活跃，已成功用于多种药物载体表面修饰。
脂质体是由一层或多层同心脂质双分子层包围水相核心组成的球形囊泡，是NDV中应用最成熟的载体之一。Akbari等人采用抗VEGFR2纳米抗体修饰包载阿霉素的脂质体，构建Lip-DOX-Nb脂质体递送系统。流式细胞术证明HUVEC对这些抗VEGFR2偶联脂质体的摄取显著增强，且Lip-DOX-Nb对VEGFR2阳性HUVEC表现出更强细胞毒性，诱导HUVEC凋亡并减弱U87癌细胞迁移。树枝状聚合物是由径向对称、逐层排列的分支单体组成的球形聚合物纳米颗粒。Wu等人用抗EGFR纳米抗体（7D12）修饰PEG化树枝状纳米颗粒以递送四价铂(IV)前药，该递送系统因体积大而具有较长半衰期和增加的肿瘤药物蓄积，在A431（EGFR+）肿瘤异种移植裸鼠模型中表现出显著增强的抗肿瘤效力。Wu等人还开发了利用微生物转谷氨酰胺酶（TGase）的酶介导位点特异性PEG化策略，通过引入特异性谷氨酰胺标签实现精确偶联，并构建了基于抗EGFR纳米抗体的PEG化/阿霉素/HSA-上转换纳米颗粒复合递送系统，在EGFR阳性A431细胞中显示显著阿霉素蓄积和细胞毒性，而对EGFR阴性MCF-7细胞作用极小。此外，特定纳米抗体已成功应用于聚合物胶束、白蛋白纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和金纳米颗粒的表面修饰。刺激响应释放技术也可整合到NDV构建中，实现靶向血管生成区域内的受控药物释放。
尽管NDV平台多样性令人印象深刻，但该领域面临临床可转化性的重大审查。临床前疗效数据绝大多数来自皮下异种移植瘤，这些模型相对于自发原位瘤或患者来源肿瘤会高估EPR效应。此外，长期生物安全性数据缺乏，特别是关于载体生物降解和生物相容性。无机纳米颗粒如金和二氧化硅存在网状内皮系统内慢性滞留的特定风险，引发累积性器官毒性问题。
尽管大多数NDC和NDV研究已在体外和体内肿瘤模型中显示出令人鼓舞的效力，但支持数据主要限于早期临床前研究，缺乏长期安全性和稳定性研究。当前靶向血管生成的递送系统主要集中于肿瘤适应症，而在其他血管生成依赖性疾病如wAMD中的应用仍处于早期探索阶段。近期，无载体或最小载体系统在纳米药物递送领域获得显著发展势头，这些设计利用特定药物分子或偶联物的自组装能力形成纳米颗粒，在保持精准靶向、稳定药代动力学和治疗效力的同时最大化单位体积药物载荷。鉴于纳米抗体小分子量、模块化和高靶点特异性的固有属性，新型无载体或最小载体策略可应用于开发自组装纳米抗体-药物系统。
4.4 基于纳米抗体的分子探针
病理性血管生成在其发生、进展和治疗反应中涉及复杂的时空动态。与传统形态学成像模式相比，分子成像能够非侵入性、实时、定量地可视化体内血管生成相关分子和细胞事件，推动疾病管理向早期分子识别、精确分型、动态疗效监测和诊疗一体化转变。凭借独特药代动力学特性，纳米抗体已广泛应用于多种分子成像模态，催生了针对免疫正电子发射断层扫描（PET）、免疫单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和近红外荧光（NIRF）成像定制的工程策略。
在核医学成像中，纳米抗体可进行位点特异性或随机放射性核素偶联。正电子发射核素（如
18F、
68Ga和
89Zr）通常用于PET成像，而γ发射核素（如
99mTc、
131I和
177Lu）用于SPECT成像。早期研究成功将EGFR靶向纳米抗体与
68Ga（
68Ga-7D12）和
99mTc-三羰基（
99mTc-8B6和
99mTc-7C12）偶联，在荷瘤裸鼠中这些示踪剂表现出高肿瘤摄取、低肝滞留和快速血液清除。研究人员还将靶向巨噬细胞甘露糖受体（MMR）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的纳米抗体用
99mTc放射性标记，分别用于类风湿关节炎和动脉粥样硬化动物模型的SPECT/微型CT成像，证实这些分子探针能灵敏、可重复地监测疾病特异性病理变化。多项临床前成就已迅速推进至临床验证，如VCAM-1靶向的
99mTc-cAbVCAM1–5免疫SPECT示踪剂已进入I期临床试验评估动脉粥样硬化炎症负担；MMR靶向纳米抗体示踪剂[
68Ga]Ga-NOTA-anti-MMR-VHH2正进行I/II期临床试验。
近红外荧光（NIRF）成像是另一种常用体内成像模态。将近红外荧光团与靶向肿瘤血管生成的抗体偶联可生成探针，在实体瘤切除期间提供实时术中导航。由于快速血液清除和深层组织穿透能力，纳米抗体有望成为NIRF成像探针的理想选择。早期研究将IRDye800CW荧光团与EGFR靶向纳米抗体偶联，成功实现小鼠模型中原位舌肿瘤和宫颈淋巴结转移的精确术中定位。Debie等人将IRDye800CW偶联的抗HER2纳米抗体用于HER2阳性乳腺癌模型成像，该探针清晰显示亚毫米级病变，肿瘤蓄积速度比曲妥珠单抗快20倍，表现出优异的肿瘤-背景对比度。近期研究报道了αvβ3整合素靶向的诊疗一体化纳米抗体-药物前药，利用谷胱甘肽响应性二硫键连接头实现肿瘤微环境内阿霉素选择性释放，同时掺入的aza-BODIPY近红外荧光团提供可激活成像功能。然而，可激活荧光团和载荷的掺入增加了体内稳定性、生物利用度和可预测激活动力学的复杂性，且载荷偶联导致的分子尺寸增加可能损害裸纳米抗体固有的组织穿透优势。
此外，超声、磁共振成像（MRI）和量子点（QD）技术可与纳米抗体整合开发新型分子成像模态。超声分子成像需要微泡，偶联抗VCAM-1纳米抗体的微泡已成功用于荷瘤小鼠超声成像，并在动脉粥样硬化小鼠模型和离体人标本中证明临床转化潜力。纳米抗体包被的超顺磁纳米颗粒和磁性脂质体也已成功用于肿瘤MRI。量子点是球形光致发光半导体纳米晶体，可作为药物载体并包被抗EGFR纳米抗体用于诊疗应用，但生物相容性差限制其应用。
近期，基于纳米抗体的成像研究已从独立诊断转向诊疗一体化。放射性核素如
131I和
177Lu发射适合SPECT成像的γ射线，同时作为中能β
?粒子发射体，与纳米抗体偶联后可对微转移灶和残留病变进行靶向放疗。在光动力疗法（PDT）中，纳米抗体常作为靶向模块与近红外发射光敏剂偶联，利用NIRF成像精确描绘肿瘤浸润边缘，同时实现激光诱导活性氧（ROS）产生，触发肿瘤细胞凋亡或坏死。整合NIRF和核医学成像的双模态纳米抗体示踪剂已成为重要研究方向，实现了时空互补：放射性核素成像的深层组织敏感性利于术前规划，而术中荧光成像提供实时视觉引导。
分子探针临床成功的根本生物学障碍是肿瘤和血管异质性。血管生成相关靶点在不同患者甚至同一肿瘤内表达不一致，单靶向探针在靶点下调时可能产生假阴性。这促进了多特异性探针的研究兴趣，但这些构建体面临严峻的可开发性挑战：增加的分子量和流体力学半径直接损害肾脏清除，可能加剧放射性同位素的肾脏滞留等脱靶毒性。未来策略或优先考虑将广谱血管生成标志物与异质性特异性或免疫检查点标志物配对，在最大化信息获取的同时最小化结构冗余。
4.5 Nb-CAR-T
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液恶性肿瘤中已取得显著临床疗效，但其在实体瘤中的应用仍受肿瘤微环境免疫抑制和T细胞浸润不足的限制。基于单链可变片段（scFv）的传统CAR结构容易错误折叠或聚集，引发配体非依赖性紧张信号和T细胞过早耗竭。相比之下，基于纳米抗体的CAR为单体且高度可溶，促进可靠折叠并降低聚集倾向，减少基础信号并增强工程T细胞的功能持久性。但纳米抗体性能仍高度依赖具体克隆选择、亲和力和CAR结构，常需广泛并排筛选以确定最佳候选。
近期研究表明，Nb-CAR-T细胞在靶向肿瘤血管微环境时表现出卓越抗肿瘤活性。2019年，Taheri等人开发了靶向VEGFR2的第二代基于VHH的CAR-T细胞，这些细胞特异性裂解VEGFR2阳性血管内皮细胞，同时诱导T细胞活化和白细胞介素-2（IL-2）及IFN-γ分泌。2024年，该团队通过调整间隔区长度优化设计，构建的新一代Nb-CAR-T细胞表现出增强的细胞因子释放和对VEGFR2阳性靶标的细胞毒性。然而，VEGFR2在健康血管内皮上组成性表达，靶向该抗原的CAR-T治疗易产生剂量限制性毒性。鉴于CD105（Endoglin）和EIIIB（ED-B）纤连蛋白变体在肿瘤新生血管内皮细胞上的高特异性表达，它们是设计破坏血管微环境的Nb-CAR-T细胞的理想靶点。Mo等人利用CRISPR/Cas9技术在AAVS1位点进行位点特异性基因敲入，成功获得稳定表达CAR的CAR-T细胞系，体内外实验证实靶向CD105可同时裂解肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞。靶向EIIIB（ED-B）纤连蛋白变体的Nb-CAR-T细胞通过直接细胞毒性和营养剥夺发挥强效抗肿瘤作用。然而，关键空白仍然存在：CD105在伤口愈合和胎盘发育等生理过程中的内皮细胞上上调，其靶向在非恶性情境下存在切实的on-target, off-tumor毒性风险；ED-B虽具有更肿瘤限制性特征，但其跨组织学异质性表达及在若干富血管恶性肿瘤中的稀缺性限制了广泛临床效用。此外，当前临床前疗效数据主要来自皮下细胞系来源异种移植瘤（CDXs），无法重现人类实体瘤的标志性结缔组织增生基质和免疫抑制微环境。
近年来，纳米抗体的模块化特性不断扩展CAR-T工程设计边界。通过多价靶向设计构建的串联CAR（TanCARs）有效克服肿瘤抗原异质性和免疫逃逸；纳米抗体的模块化也推动了逻辑门控和可调CAR系统的发展，显著提高治疗安全性和靶向精度。总之，VHH独特的理化性质和工程多功能性使Nb-CAR-T细胞成为实体瘤治疗特别是血管破坏策略的有前景平台。
4.6 靶向血管生成纳米抗体的整合工程
上述工程策略并非功能孤立，因为每种修饰都会影响多个相互依赖的属性，而每个生物学屏障往往需要结合多种方法。人源化主要降低重复给药期间抗药免疫应答风险，同时为后续多价融合、多特异性组装、偶联和细胞工程提供合适的序列和结构基础。多价组装通过亲合力增加功能性亲和力，可能增强靶点保留和系统暴露。白蛋白结合结构域和其他半衰期延长模块进一步减少快速肾脏清除。然而，这些修饰增加了分子尺寸，可能部分削弱单体纳米抗体的组织穿透优势。亲和力、血清半衰期和组织穿透性必须综合优化：紧凑单体可能更适合快速成像、局部给药或进入灌注不良病变，而多价或半衰期延长形式可能更适合持续全身抑制血管生成信号。
多价、多特异性、药物递送和CAR-T工程代表功能增强的重叠层次：多价增强抗原参与，多特异性扩展通路覆盖，偶联引入药理学效应器，CAR-T技术提供可扩增的细胞免疫应答。它们的协调应用可改善靶点参与、解决抗原和通路异质性并减少治疗耐药。放射性标记或荧光纳米抗体可确定候选靶点是否充分表达和可及，紧凑或半衰期延长形式是否到达预期组织区室，靶点异质性是否可能限制单特异性治疗。纵向成像还可揭示靶点丢失、组织穿透不完全、血管重塑或替代血管生成通路激活，从而支持基于耐药信息的治疗调整。
集体而言，人源化、多价和多特异性组装、药物偶联、分子成像和Nb-CAR-T工程的重叠功能为关键生物学屏障提供了广泛覆盖，包括亲和力、特异性、组织穿透、血清半衰期、免疫激活和治疗耐药。这种模块化整合不是定义单一普遍最优格式，而是扩展靶向血管生成纳米抗体在诊断成像、持续通路抑制、靶向药物递送、免疫调节和过继细胞治疗中的应用。
5 潜在适应症
靶向血管生成的纳米抗体具有高组织穿透性和工程灵活性，已从最初聚焦肿瘤学扩展到眼部新生血管疾病，凸显了其治疗其他多种血管相关疾病的潜力。
早期研究主要集中于抑制肿瘤血管生成；例如，以BI 836880为代表的VEGF/Ang2双靶向纳米抗体融合蛋白，已在晚期实体瘤患者中作为单药或与PD-1阻断联合进行了I期评估，建立了推荐剂量并显示出可控的安全性特征和初步抗肿瘤活性。同时，眼内递送系统的进步和小分子抗体片段良好的扩散特性使纳米抗体在治疗wAMD和DME方面取得突破。其低分子量允许在玻璃体腔内高效扩散，与新型长效递送技术结合时有望克服传统抗VEGF疗法频繁给药的局限。值得注意的是，病理性新生血管驱动多种慢性疾病，包括类风湿关节炎、器官纤维化和缺血性损伤，这为扩展纳米抗体适应症提供了生物学依据。在类风湿关节炎中，VEGF/Ang-2介导的滑膜血管翳形成与骨侵蚀密切相关，抗VEGF抗体可有效抑制关节炎模型中的滑膜血管翳增殖。类似地，抑制异常血管生成可能缓解肝纤维化和肺纤维化的进展。新生血管化还影响银屑病、动脉粥样硬化和血管畸形等疾病的进展。然而，目前大多数基于纳米抗体的抗血管生成治疗研究在肿瘤模型中进行，向非肿瘤适应症的外推仍属初步阶段。抗VEGF纳米抗体已在临床前关节炎模型中显示抑制滑膜血管生成效力，但类风湿滑膜的致密基质成分和缺乏EPR效应可能限制其体内穿透。同样，纳米抗体在纤维化疾病中的效用仍属假设，目前数据仅限于血管生成与纤维化之间的
