《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Sensitive and rapid detection of Candida tropicalis using closed dumbbell-mediated isothermal amplification
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摘要
引言：热带念珠菌（Candida tropicalis）在侵袭性念珠菌病病例中占相当比例，被公认为仅次于白色念珠菌（Candida albicans）的第二大常见致病菌。有文献记载，由热带念珠菌引起的侵袭性全身感染和脓毒症病例增加，导致易感患者群体
摘要
引言：热带念珠菌（Candida tropicalis）在侵袭性念珠菌病病例中占相当比例，被公认为仅次于白色念珠菌（Candida albicans）的第二大常见致病菌。有文献记载，由热带念珠菌引起的侵袭性全身感染和脓毒症病例增加，导致易感患者群体死亡率上升，凸显了加强临床警觉性的迫切需求。早期检测热带念珠菌对于指导适当的抗真菌治疗至关重要，且与改善临床结局相关。
方法：为满足快速、可靠检测热带念珠菌的需求，本研究旨在开发一种新型闭合哑铃介导的等温扩增（closed dumbbell-mediated isothermal amplification, CDA）检测方法，其特点是高速、高特异性和高效率。研究人员成功设计、筛选并验证了一组针对热带念珠菌保守ITS2基因的特异性CDA引物，从而建立了一种简单高效的检测方法。用于体外诊断的热带念珠菌CDA检测方法表现出稳健的性能，其灵敏度、稳健性、稳定性和特异性通过364批不同来源的DNA样本进行了系统评估。
结果：热带念珠菌CDA检测方法在主要评估中表现出完美的诊断性能，使用364批不同来源的DNA样本，其表观灵敏度为100%（95%置信区间[CI]=97.0%–100%），特异性为100%（95%CI=98.5%–100%），准确度为100%（95%CI=99.0%–100%），检测限为5.6×10?6 ng/μl（约10拷贝/μl），与实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）无显著差异，表明其分析灵敏度相当。
讨论：热带念珠菌CDA检测方法在实时荧光和终点可视化两种格式下均得到验证，显示出高特异性、灵敏度和准确度，以及良好的稳定性和可重复性，支持其未来的应用潜力。
**论文解读：基于闭合哑铃介导的等温扩增技术快速检测热带念珠菌的研究**
**研究背景与问题**
热带念珠菌（Candida tropicalis）是仅次于白色念珠菌（Candida albicans）的第二大常见侵袭性念珠菌病致病菌，在免疫功能低下患者中易引发全身性感染和脓毒症，死亡率高达40%且预后较差。流行病学数据显示，热带念珠菌感染具有更强的毒力，更易进展为念珠菌血症，且对氟康唑等标准抗真菌药物的耐药性正以比白色念珠菌更快的速度增长。然而，现有检测方法存在明显局限：商业化的CHROMagar?培养法耗时长且可能出现假阴性；基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）虽快速准确，但设备昂贵、需要专业人员操作，在资源有限地区难以推广；聚合酶链反应（PCR）和DNA测序虽灵敏特异，但依赖复杂的热循环仪器和严格的操作环境；环介导等温扩增（LAMP）虽已成功商业化，但存在引物设计复杂、非特异性扩增率高等问题。因此，亟需开发一种快速、灵敏、特异且适用于现场检测（point-of-care, POC）的热带念珠菌检测方法。
**研究内容与结论**
本研究旨在建立一种基于闭合哑铃介导的等温扩增（closed dumbbell-mediated isothermal amplification, CDA）的新型检测方法，用于热带念珠菌的快速鉴定。研究人员成功设计并筛选了针对热带念珠菌保守ITS2基因的特异性CDA引物，并通过添加加速引物（外引物）进一步优化了反应效率。该检测方法在实时荧光和终点可视化两种模式下均表现出优异的性能：检测限低至5.6×10
?6 ng/μl（约10拷贝/μl），与实时定量PCR（qPCR）相当；在364批不同来源的DNA样本（包括标准菌株和临床样本）中，表观灵敏度、特异性和准确度均达到100%（95%CI分别为97.0%–100%、98.5%–100%和99.0%–100%）。该检测方法对近缘念珠菌（如光滑念珠菌Candida glabrata、近平滑念珠菌Candida parapsilosis、白色念珠菌）及其他11种非念珠菌病原体（如铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae等）均无交叉反应，显示出极高的特异性。总检测时间仅为60分钟，显著短于常规PCR的120分钟。该研究成果发表在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》上。
**主要关键技术方法**
本研究采用的关键技术方法包括：（1）闭合哑铃介导的等温扩增（CDA）技术，通过设计针对热带念珠菌ITS2基因（GenBank登录号MT149217.1）的内引物（MF/MR）和外加速引物（F2/R2），在60°C恒温条件下实现核酸快速扩增；（2）实时荧光监测（使用EvaGreen染料）和终点可视化检测（使用羟基萘酚蓝HNB染料）两种信号读取模式；（3）样本队列来源：标准菌株（BNCC 186815）购自北纳生物（BNCC），临床DNA样本（包括26份热带念珠菌、4份白色念珠菌、4份光滑念珠菌、3份近平滑念珠菌及11种非念珠菌病原体）于2024年7月至11月收集自宁波大学附属第一医院检验科，并通过二代测序（NGS）确认。
**研究结果**
**3.1 热带念珠菌CDA引物的设计与筛选**
通过计算机模拟评估，选择四对候选内引物进行实验验证。实时扩增曲线和熔解曲线分析显示，第四组引物对在相同DNA浓度（5.6×10
?2 ng/μl）下具有最低的循环阈值（Ct值，22分钟），且熔解温度（Tm）为77.50°C，无非特异性扩增。终点可视化检测进一步确认第四组引物适用于现场检测。八次重复阳性和阴性验证表明该引物组具有高重复性和稳定性。
**3.2 热带念珠菌CDA引物组的优化**
添加外加速引物后，CDA反应效率显著提高：Ct值从22分钟降至17分钟（缩短5分钟），且熔解曲线分析显示无非特异性扩增，Tm值一致（77.50°C），证实了不同批次间具有良好的可重复性。
**3.3 热带念珠菌CDA检测方法的检测限测定**
通过10倍梯度稀释的热带念珠菌DNA（5.6×10
?1至5.6×10
?7 ng/μl）进行检测，实时荧光曲线和颜色变化均显示最低检测限为5.6×10
?6 ng/μl（约10拷贝/μl），与qPCR方法的检测限相当。阳性产物Tm值稳定在77.50°C。
**3.4 热带念珠菌CDA检测方法的灵敏度和特异性评估**
使用60批临床热带念珠菌DNA样本、3种近缘念珠菌（白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌）及11种非念珠菌病原体DNA样本进行检测。实时荧光扩增曲线和熔解曲线均显示CDA方法仅特异性扩增热带念珠菌DNA，其他病原体均无信号。终点可视化颜色变化与实时荧光结果一致。统计结果显示，在120批热带念珠菌样本和244批非目标临床DNA样本中，灵敏度、特异性和准确度均为100%（95%CI分别为97.0%–100%、98.5%–100%和99.0%–100%）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究建立的热带念珠菌CDA检测方法在分析性能上优于现有方法（如培养法、MALDI-TOF MS、PCR、LAMP），具有快速（60分钟）、高灵敏、高特异、操作简便等优势，适用于实时荧光监测和终点可视化现场检测。但研究存在局限性：所有临床样本来自单一中心、采集时间仅5个月，可能限制结果的普遍性；目前仅对纯化DNA进行验证，尚未直接测试粗制标本；未与MALDI-TOF MS进行直接比较（因后者为表型/蛋白质组学方法，而本研究为基因型方法）。未来需通过多中心、不同季节的纵向采样进行外部验证，并开发直接检测粗制标本的适配方案。
结论部分翻译：在本研究中，研究人员开发了一种热带念珠菌CDA检测方法，该方法能够通过实时扩增或可视化比色终点实现快速、灵敏且特异的DNA检测。该方法有望简化热带念珠菌的诊断，并为该病原体引起的感染提供有效的临床管理依据。当应用于基于荧光的微流控平台时，基于实时扩增曲线的热带念珠菌CDA检测方法显示出显著提高的效率。凭借其终点可视化读数，热带念珠菌CDA检测方法可在标准水浴中进行，为在不发达地区开发POC检测提供了未来方向。
