《Nucleic Acids Research》：Rapid discovery of monoclonal antibodies via high-throughput single BCR affinity sequencing
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为了大规模同时捕获抗原结合亲和力与配对的重链-轻链序列，一直是单克隆抗体发现的瓶颈。研究人员在此提出了抗原亲和力BCR测序（Antigen Affinity BCR-seq，AAB-seq），这是一种高通量单细胞测序平台，能够获取数千条配对天然BCR序列的相对
为了大规模同时捕获抗原结合亲和力与配对的重链-轻链序列，一直是单克隆抗体发现的瓶颈。研究人员在此提出了抗原亲和力BCR测序（Antigen Affinity BCR-seq，AAB-seq），这是一种高通量单细胞测序平台，能够获取数千条配对天然BCR序列的相对抗体-抗原亲和力。AAB-seq采用双标记抗原和DNA条形码标记的抗轻链抗体，计算与抗体-抗原结合强度成正比的AAB分数。结合快速、低成本的直接克隆工作流程，该平台无需从头合成抗体基因即可实现亲和力引导的抗体回收。经鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和SARS-CoV-2受体结合域（receptor-binding domain，RBD）验证，AAB-seq发现了与酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）结果强相关的强效抗体，包括具有强效效应功能的新型SARS-CoV-2中和抗体。总之，AAB-seq加速了抗体筛选，并可能为机器学习驱动的治疗性抗体设计与开发提供大规模序列-亲和力数据集。
**论文解读：基于高通量单BCR亲和力测序的快速单克隆抗体发现**
**研究背景与问题**
单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）凭借其精准的靶点特异性和免疫效应功能调节能力，已成为肿瘤学与免疫学领域的基石性治疗药物。传统抗体发现流程依赖反复筛选与功能验证，成本高、周期长，且通常需要筛选大量候选分子。亲和力是决定抗体功能与治疗潜力的关键参数，但现有高通量技术难以在获取配对重链-轻链（heavy-light，H-L）V(D)J序列的同时直接定量抗体-抗原亲和力。例如，基于10x Genomics平台的LIBRA-seq技术虽能将抗原特异性与BCR序列关联，但仅能反映细胞表面总抗原结合量，无法区分由高BCR表面表达导致的假阳性信号与真正的高亲和力结合，在新冠疫情期间的抗体筛选中成功率仅为20%–50%。此外，传统下游验证常需商业合成全长抗体基因，成本高昂。因此，亟需一种能够在单次实验中同时获取配对V(D)J序列、估计抗体亲和力并支持低成本克隆的高通量方法。
**研究目的与研究内容**
研究人员开发了抗原亲和力BCR测序（Antigen Affinity BCR-seq，AAB-seq）平台，旨在实现单细胞水平上数千条BCR的配对重轻链序列与相对抗原亲和力的并行测量。AAB-seq通过计算每个B细胞表面抗原结合量与BCR丰度的比值（即AAB分数）作为亲和力代理指标，并整合直接PCR克隆工作流程，仅需合成15–30个核苷酸的引物即可从cDNA文库中回收目标抗体基因，无需从头合成全长基因。研究在鸡卵清蛋白（OVA）和SARS-CoV-2受体结合域（RBD）两种免疫模型中验证了该平台的有效性，并进一步评估了所筛抗体的中和活性及效应功能。
**关键技术方法**
研究人员采用以下核心方法：双标记抗原策略，即同时使用荧光染料（Alexa Fluor 647）和DNA条形码寡核苷酸标记抗原，用于定量细胞表面抗原结合；DNA条形码标记的抗轻链抗体（BCR-LC）用于测量BCR表面丰度；利用10x Genomics单细胞V(D)J测序平台（5′基因表达与V(D)J分析）联合表面蛋白条形码技术，并行获取转录组、BCR序列和表面蛋白标签；采用流式细胞分选（FACS）富集抗原阳性B细胞；应用巢式PCR直接从10x Genomics cDNA文库中克隆目标BCR序列至表达载体；通过ELISA、生物层干涉法（BLI）和表面等离子体共振（SPR）验证结合活性与动力学；采用假病毒中和实验、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和抗体依赖性补体沉积（ADCD）实验评估抗体的功能活性。样本来源于免疫的BALB/c雌性小鼠脾细胞（OVA实验混合3只，RBD实验混合2只，独立重复实验混合2只）。
**研究结果**
**AAB-seq原理与工作流程**
AAB-seq同时以DNA条形码标记的抗原、荧光标记的抗原和DNA条形码标记的抗轻链抗体孵育B细胞，经FACS富集后进行单细胞V(D)J测序。通过计算每个B细胞抗原UMI计数与BCR-LC UMI计数之比的自然对数，得到AAB分数。该分数可消除BCR表达丰度差异带来的影响，比原始抗原结合信号更准确。
**OVA模型验证AAB分数与ELISA强相关**
在OVA免疫小鼠模型中，研究人员回收了2928个具有配对重轻链序列的B细胞，选出17个覆盖不同AAB分数和表面抗原丰度的κ轻链抗体进行重组表达和ELISA检测。结果显示，AAB分数与ELISA曲线下面积（AUC）呈强相关（Pearson r=0.8597，Spearman ρ=0.8333），而表面抗原丰度与ELISA的相关性较弱（r=0.44745，ρ=0.4240）。筛选10个高AAB分数抗体，全部表现出阳性结合，证明AAB分数可作为有效的亲和力筛选指标。
**AAB分数校正B细胞亚型特异性BCR丰度偏差**
通过转录组聚类，OVA数据集中鉴定出10个B细胞亚群，包括未成熟B细胞、活化B细胞、记忆B细胞和浆细胞。浆细胞和记忆B细胞表面BCR丰度较低，但其AAB分数显著高于其他亚群。仅用表面抗原丰度无法反映这些细胞的高亲和力特征，而AAB分数通过归一化BCR丰度，成功揭示了这些成熟B细胞亚群的真实高亲和力潜力。
**AAB分数与BCR频率及体细胞高频突变相关联**
研究发现BCR重轻链配对频率与AAB分数总体呈正相关，高频率配对更可能具有高AAB分数，但该相关性并非绝对。此外，高AAB分数抗体中可恢复高体细胞高频突变（SHM）序列，证实流程无偏倚。与仅依赖V基因配对频率或SHM的间接指标相比，AAB分数提供了直接的功能读数，能更精确地预测抗体亲和力。
**SARS-CoV-2 RBD模型中的验证**
在SARS-CoV-2 RBD免疫小鼠中，AAB-seq回收3622个配对B细胞。ELISA验证14个抗体显示AAB分数与ELISA分数的相关性（r=0.71872）显著优于表面抗原丰度的相关性（r=0.35062）。按AAB分数和抗原丰度分组的20个抗体中，G1组（高AAB分数）的8个抗体均呈现强ELISA信号，而G3组（低AAB分数但高抗原丰度）仅1/4阳性，证明AAB分数优于表面抗原丰度。BLI测得G1组8个抗体的KD在2.1×10
-10至7.8×10
-9 M之间。
**假病毒中和与免疫刺激功能**
从G1组中选取8个高AAB抗体及2个低AAB抗体进行功能实验。其中1743-3和1743-13对SARS-CoV-2野生型假病毒具有中和活性，IC50分别为2.25 μg/ml和18.58 μg/ml。ADCP实验显示多数高AAB抗体可诱导THP-1细胞吞噬RBD包被微球，ADCD实验显示1743-3和1743-13能有效沉积补体C3b，表明这些抗体具有潜在治疗相关的效应功能。
**独立生物学重复验证**
在独立的小鼠免疫批次中，研究人员前瞻性选择20个κ轻链抗体，按AAB分数高低和表面RBD丰度分为三组。ELISA结果显示，所有高AAB分数抗体均表现出强RBD结合，而低AAB分数抗体几乎无结合，与首次实验一致。BLI和SPR确认高AAB抗体具有纳摩尔级KD值，证明了AAB-seq在不同生物学样本和免疫条件下的稳健性和可重复性。
**讨论与结论**
AAB-seq首次实现了在单次高通量测序中同时获取BCR配对序列和定量亲和力代理指标，弥补了传统表面抗原丰度测量混淆受体密度与结合强度的缺陷。该平台不仅显著提高抗体筛选效率（从8个候选抗体中即可获得治疗性中和抗体），更重要的是可为机器学习模型生成大规模序列-亲和力配对数据集，克服因训练数据不足导致的过拟合问题。研究亦指出其局限性：AAB分数仅能在κ或λ轻链亚群内部进行比较；无法反映翻译后修饰对抗体亲和力的影响；存在环境抗体标签污染的可能性极低但不可完全排除；基于AAB分数优先排序可能偏向高克隆扩增谱系，限制抗体库多样性。未来该技术有望扩展至分泌型抗体亲和力测量以及与TCR筛选结合用于免疫治疗。总体而言，AAB-seq为高通量抗体发现和免疫受体生物学研究提供了强大工具。
