类病毒是一类独特的植物病原体，仅由小（240–420 nt）、环状、单链非编码 RNA 组成，这些 RNA 采用高度碱基配对的二级结构。尽管缺乏编码蛋白的能力，类病毒仍能通过劫持宿主转录和 RNA 加工 machinery，通过不对称或对称滚环复制途径自主复制（Biao, 2009）。根据其复制位点，类病毒被分为两个科：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae），在细胞核中复制；和鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae），在叶绿体中复制（Owens, Hammond, 2009）。几种类病毒是农业上重要的病原体，导致与生长迟缓、黄化、树皮开裂、果实畸形以及经济作物产量损失相关的严重疾病（Hadidi et al., 2017）。
早期的超微结构和原位杂交研究也揭示了类病毒 RNA 链在复制过程中在亚细胞核区室中的差异定位（Qi, Ding, 2003），而基于共聚焦显微镜的方法展示了马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）在感染番茄细胞的细胞核内积累（Harders et al., 1989）。同样，鳄梨日斑类病毒（ASBVd）被定位在叶绿体类囊体膜上，而椰子卡当卡当类病毒主要积累在细胞核内，突出了不同类病毒科之间的区室特异性定位模式（Bonfiglioli et al., 1994）。最近，同时可视化 PSTVd RNA 和 RNA 聚合酶 II 进一步强调了空间分辨成像方法在理解类病毒复制生物学和宿主相互作用中的重要性。
除了复制之外，类病毒生物学中另一个重要但尚未完全理解的方面是其系统性运输和长距离移动。尽管缺乏编码蛋白的能力，类病毒仍能通过利用宿主 RNA 结合蛋白和运输 machinery，高效地通过胞间连丝和维管束组织移动（Ding, 2009, Flores et al., 2017）。先前的研究表明，类病毒 RNA 结合蛋白 1（VIRP1）与 PSTVd RNA 相互作用，而免疫 -FISH 分析证明了类病毒 RNA 与宿主蛋白的共定位，支持了在感染过程中核糖核蛋白复合物的形成（Martínez de Alba et al., 2003, Ma et al., 2022）。在瓜类作物中，韧皮部蛋白 2（PP2）也被证明与类病毒 RNA 相互作用（Gómez and Pallás, 2004, Walia et al., 2015）。然而，直接在感染组织和细胞区室中可视化苹果瘢痕皮肤类病毒（ASSVd）的方法仍然有限。
常规方法如 RT-PCR、北方印迹法和聚丙烯酰胺凝胶电泳对于检测和定量类病毒 RNA 具有高度敏感性，但未能提供有关组织分布和亚细胞定位的空间信息（Flores et al., 2017）。荧光原位杂交（FISH）为在完整组织和细胞区室中直接可视化核酸提供了一种强大的替代方案（Rudkin, Stollar, 1977）。基于 FISH 的方法以前曾用于定位维管束和非维管束组织中的 PSTVd、葫芦矮缩类病毒（HSVd）和番茄褪绿矮缩类病毒（TCDVd）（Adkar-Purushothama and Perreault, 2020, Harders et al., 1989, Matsushita et al., 2011, Qi and Ding, 2003）。然而，目前缺乏针对 ASSVd 定位（特别是在草本实验系统中）的稳健优化方案。
ASSVd 是苹果瘢痕类病毒属（Pospiviroidae）的一员，是一种感染苹果和其他蔷薇科寄主的經濟上重要的病原体（Hashimoto, Koganezawa, 1987）。该病毒也感染黄瓜，由于其发育良好的维管束系统、丰富的韧皮部组织以及适合组织水平分析，黄瓜作为一种方便的实验寄主（Walia et al., 2014）。因此，瓜类组织为研究类病毒 RNA 的维管束定位和空间分布提供了一个极好的模型。尽管 ASSVd 已使用分子检测方法进行了广泛研究，但其组织和亚细胞定位仍然表征不良（Khan et al., 2015; Kim et al., 2022）。
在本研究中，我们优化了一种基于 FISH 的工作流程，用于在黄瓜组织中进行 ASSVd 的空间和亚细胞定位。生成了全长负链核酶探针，并使用基于荧光素和 AZDye594 CTP 的标记化学性质进行了系统评估，以提高信号敏感性并尽量减少组织自发荧光。包括组织制备、固定、杂交条件、探针化学性质和感染阶段在内的实验参数均进行了优化，以提高可重复性和检测敏感性。使用这种方法，检查了不同感染阶段的茎和叶组织中的 ASSVd 定位，以评估组织分布、维管束关联和亚细胞定位模式。这种优化的方案为在植株内可视化类病毒 RNA 提供了一个稳健的平台，并可能促进未来研究类病毒运输、宿主相互作用、RNA 移动性以及与植物相关的非编码 RNA 定位的研究。此外，除了检测之外，优化后的 FISH 工作流程提供了一个空间框架，将类病毒 RNA 定位与生物学过程（如细胞核积累/复制、韧皮部相关运输）以及未来与宿主 RNA 结合或 RNA 沉默因子的共定位研究联系起来。
