空间多组学揭示视网膜病理生态位中的鞘脂代谢重编程

《iMeta》：Spatial multi-omics unveils sphingolipid metabolic reprogramming within the retinal pathological niche

　　

视网膜缺血再灌注（RIR）损伤是青光眼及其他视网膜疾病中不可逆视力丧失的核心机制，然而致病性微环境的空间组织仍知之甚少。在此，研究人员构建了一个高分辨率、全眼球的空间多组学图谱，整合了Stereo-seq转录组学和基于MALDI-MSI的代谢组学，以捕捉RIR小鼠模型中的早期分子事件。在空间上，视网膜神经节细胞（RGC）与周围细胞的相互作用在损伤后显著减少，而免疫-胶质细胞相互作用增强，揭示了从以神经元为中心向免疫代谢状态的转变。在神经节细胞层（GCL），即主要病理位点，研究人员鉴定出Trem2⁺小胶质细胞原位扩增，与退化的RGCs建立紧密邻近关系，并与失调的鞘脂代谢表现出强烈的空间关联。在机制上，利用Trem2敲除小鼠和小胶质细胞特异性Trem2 siRNA敲低，研究人员证明TREM2直接结合SPTLC2（从头鞘脂生物合成的限速酶），驱动以神经酰胺为中心的代谢重编程，调节AKT-mTOR信号轴并放大炎症激活。用myriocin（一种丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）的药理学抑制剂）可逆转这一级联反应，保护RGCs。对人类青光眼房水多组学数据集的整合进一步揭示了鞘脂生物合成酶、鞘脂代谢物和脂质感应免疫效应物的保守上调，提供了初步的转化线索。总之，研究人员的发现揭示了空间定义的免疫代谢重塑——其中Trem2⁺小胶质细胞是核心——汇聚于鞘脂代谢作为可药物调控轴，因此TREM2-SPTLC2界面成为视网膜神经退行性疾病的新治疗机会。

**论文解读：空间多组学揭示视网膜缺血再灌注损伤中鞘脂代谢重编程的生态位依赖性机制**

**1. 研究背景与问题**

视网膜缺血再灌注（RIR）损伤是青光眼及多种眼科急症（如视网膜动脉阻塞）导致不可逆视力丧失的核心病理机制。血供中断引发严重缺氧和能量耗竭，再灌注后活性氧爆发、线粒体膜通透性转变、钙超载及炎症级联反应进一步加剧神经元死亡。然而，传统基于组织匀浆的组学方法破坏了视网膜固有的层状结构，掩盖了代谢物来源的空间异质性和细胞类型特异性贡献。因此，解析特定RGCs微环境内代谢应激如何起始、脂质信号通路如何在特定细胞邻域中失调，成为亟待解决的关键科学问题。本研究旨在通过高分辨率空间多组学技术，系统描绘RIR后全眼球分子事件的空间组织，并揭示致病性生态位内的免疫代谢重塑机制。

**2. 研究内容与结论**

研究人员利用RIR小鼠模型，整合Stereo-seq空间转录组学与MALDI-MSI空间代谢组学，构建了全眼球单细胞分辨率空间多组学图谱。研究发现，RIR损伤后视网膜内层（尤其是GCL）成为主要病理区域，Trem2⁺小胶质细胞在GCL原位扩增并与退化RGCs紧密共定位，同时伴随鞘脂代谢的局部紊乱。通过Trem2敲除小鼠和小胶质细胞特异性siRNA敲低实验，证实TREM2直接结合鞘脂从头合成限速酶SPTLC2，通过AKT-mTOR信号轴驱动神经酰胺为中心的代谢重编程，放大炎症激活。药理学抑制SPT（myriocin）可逆转该级联反应并保护RGCs。人类青光眼房水多组学数据进一步验证了鞘脂代谢酶、代谢物及脂质感应免疫效应物的上调。该研究发表在《iMeta》。

**3. 主要技术方法**

本研究采用的关键技术包括：（1）Stereo-seq空间转录组学，对RIR小鼠全眼球冠状切片（n=5 Sham, n=6 RIR，独立生物学重复）进行亚细胞分辨率转录组检测；（2）MALDI-MSI空间代谢组学，对四组眼球组织（Sham, RIR, Trem2 KO, Trem2 KO+RIR，每组n≥3）进行20μm空间分辨率脂质代谢物成像；（3）公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集整合（12个数据集，271,130个细胞，源自ArrayExpress、GEO等数据库）用于空间细胞注释；（4）Trem2全敲除小鼠及BV2小胶质细胞OGD/R模型结合siRNA敲低，进行机制验证；（5）Co-IP、分子对接及Western blot验证蛋白互作与信号通路。

**4. 研究结果**

**（1）高分辨率ST描绘RIR眼球区域特异性分子架构**
通过Stereo-seq细胞分割与空间共表达模块分析，研究人员将眼球划分为10个解剖区域（GCL、INL、ONL、RPE等），并验证了各区域标志基因（如GCL中Nefl、ONL中Rho）的准确定位。

**（2）RIR后多种细胞类型的空间重组织**
整合12个scRNA-seq数据集构建参考图谱，注释出29个细胞群体。空间密度分布显示，RIR后RGCs在GCL层分布中心外移，小胶质细胞从ONL/RPE层向GCL显著迁移聚集，免疫细胞（小胶质细胞、髓系细胞、DC）在GCL比例增加，而其他细胞类型保持解剖区室分布。

**（3）RIR诱导前段分子表达景观的深度破坏**
角膜和房角区域显示小胶质细胞浸润增加，稳态基因（Lypd2、Krt12）下调，炎症/应激基因（Lyz2、Clu）上调，通路富集显示炎症通路激活，神经发育通路抑制。

**（4）RIR在内层视网膜诱导以小胶质细胞激活为主的空间限制性炎症与分子改变**
DEGs分析显示GCL和角膜区域转录变化最显著。GSEA证实免疫相关通路上调，视觉功能通路下调。GSVA显示小胶质细胞迁移和炎症反应评分在GCL显著升高。伪时间轨迹分析揭示小胶质细胞沿GCL-INL-ONL轴从稳态向激活态转变，GCL小胶质细胞上调促炎/疾病基因（C1qa、Apoe）。邻近分析显示RGCs周围免疫细胞主要为小胶质细胞，受体-配体分析揭示Trem2-Apoe信号介导小胶质细胞-RGCs通讯。共定位分析确认TREM2和APOE蛋白在损伤后视网膜中升高。

**（5）Trem2缺失减轻早期炎症反应并促进RGCs存活**
Trem2敲除后，RIR视网膜RGCs存活率显著提高（平坦mount计数，p=0.032），内丛状层厚度无显著差异。RT-qPCR显示Trem2敲除显著降低Apoe、Trem2、TNF-α、Il1β等炎症因子mRNA水平。体外实验显示，Trem2敲低通过AKT-mTOR通路抑制OGD/R诱导的炎症因子和鞘脂代谢酶（Des1、Cers4）表达。

**（6）Trem2缺失重塑RIR诱导的视网膜代谢重塑**
空间代谢组学分析发现，在GCL+INL层，Trem2调控的77个代谢物主要富集于鞘脂代谢整合通路；69个Trem2下调代谢物富集于半胱氨酸和同型半胱氨酸降解通路。K-means聚类显示Trem2依赖性代谢物模式，且RIR与Trem2 KO+RIR组间差异显著。人类青光眼房水多组学数据确认了TREM2-鞘脂轴的保守性。

**（7）TREM2结合SPTLC2并调节AKT-mTOR信号轴**
公共scRNA-seq分析显示鞘脂代谢基因主要富集于小胶质细胞。IF显示TREM2与SPTLC2及LASS3在OGD/R小胶质细胞中共定位，Co-IP验证TREM2与SPTLC2的直接物理结合，分子对接支持结合界面。AKT/mTOR抑制剂解偶联了Trem2敲低对SPTLC2和凋亡的调控，提示Trem2通过AKT-mTOR通路调控鞘脂代谢。Myriocin（SPT抑制剂）体内外实验均减轻小胶质细胞炎症（降低TNF-α、IL1β等）。

**5. 讨论与结论**

讨论部分指出，本研究填补了RIR后全眼球转录组和代谢组空间组织的空白，揭示了GCL+INL作为核心病理区，Trem2⁺小胶质细胞在该生态位中与鞘脂代谢异常共定位。TREM2通过结合SPTLC2调控AKT-mTOR通路，驱动代谢重编程和炎症激活。研究强调Trem2在急性缺血损伤中发挥促炎作用，而非固定的神经保护角色，其功能取决于空间定位、疾病阶段和代谢环境。鞘脂代谢作为小胶质细胞炎症输出的关键调控层，提供了可药物靶点（TREM2-SPTLC2界面）。局限性包括未在纯化小胶质细胞中直接验证脂质变化、未使用条件性敲除小鼠、未进行外源性神经酰胺挽救实验等。

**结论翻译**：通过整合ST、SM和scRNA-seq多维度分析，本研究表明RIR不仅由内在神经元损伤驱动，而且由空间定义的免疫代谢重塑放大和塑造，其中Trem2⁺小胶质细胞发挥重要作用。这些发现加深了我们对青光眼相关神经退行性变细胞机制的理解，并将Trem2及其相关鞘脂代谢通路确定为精准免疫代谢干预和治疗开发的潜在靶点。