RICTOR通过调控FoxO1核输出预防高龄产妇的蜕膜化障碍

《Aging Cell》：RICTOR Prevents Decidualization Disorder in Women With Advanced Maternal Age via Regulating FoxO1 Nuclear Export

　　

高龄产妇（AMA）的流产和胚胎发育异常常与蜕膜化受损有关。mTORC2是一种进化上保守的蛋白激酶。作为mTORC2的核心组分，RICTOR已被认为与营养感知有关，并与着床障碍密切相关；然而，其在调节年龄相关蜕膜化障碍中的作用尚未有报道。在本研究中，研究人员发现AMA代孕小鼠中显著的蜕膜化缺陷，同时AMA女性的蜕膜组织中RICTOR显著减少。小鼠子宫特异性敲除Rictor导致妊娠丢失和蜕膜化受损。值得注意的是，Rictor敲低导致Akt3–FoxO1信号减弱和FoxO1核输出受损。分子和组织学分析表明，特异性RICTOR激动剂MHY1485在体内和体外有效挽救蜕膜化缺陷。这些发现表明RICTOR在衰老的蜕膜微环境中发挥重要作用，并可能作为子宫基质细胞蜕膜化的潜在生物标志物。此外，治疗性激活RICTOR代表了一种有前景的策略，以对抗AMA女性中衰老的蜕膜损伤并改善妊娠结局。

**论文解读：RICTOR通过调控FoxO1核输出预防高龄产妇蜕膜化障碍**

**研究背景与问题**

随着教育水平和职业成就的提高，全球产妇生育年龄普遍上升。高龄产妇（AMA，通常定义为分娩时年龄≥35岁）面临更高的不孕、着床失败、流产及其他不良妊娠结局风险。尽管卵巢储备下降和卵母细胞质量降低被认为是年龄相关生育力下降的关键因素，但越来越多的证据表明子宫内膜功能障碍同样起重要作用。临床研究显示，即使在整倍体胚胎移植或使用年轻捐赠者卵母细胞的情况下，AMA女性的妊娠结局仍不理想，这凸显了子宫内膜环境在生殖衰老中的重要性。

胚胎着床依赖于蜕膜化——一个孕酮依赖性过程，其中子宫内膜基质细胞分化为支持早期胚胎发育的蜕膜细胞。蜕膜化受损与着床失败和早期流产密切相关。最近研究发现，子宫内膜细胞衰老会导致蜕膜化障碍，并破坏与滋养层细胞的相互作用。例如，Woods等人的实验表明，将衰老小鼠胚胎移植到年轻子宫环境中可改善着床率。然而，年龄相关蜕膜化缺陷的分子机制仍不清楚。阐明这些机制有助于早期识别和靶向干预年龄相关不孕。

RICTOR是mTORC2复合物的核心亚基，与多种年龄相关病理有关。肝脏特异性Rictor缺失可显著缩短雄性小鼠寿命，且近期证据表明RICTOR在着床过程中参与子宫内膜上皮功能。然而，RICTOR对基质细胞和蜕膜化的影响尚不明确。Akt3–FoxO1信号轴对蜕膜化至关重要，Akt3通过磷酸化FoxO1诱导其核质穿梭，解除对关键蜕膜标志物（如PRL和IGFBP1）的转录抑制。鉴于RICTOR是Akt Ser473磷酸化所必需的，而该磷酸化是FoxO1核排除的关键步骤，研究人员假设RICTOR通过Akt3–FoxO1信号调控蜕膜化，且该通路失调可能参与年龄相关蜕膜化失败。本研究旨在探讨RICTOR在AMA相关蜕膜化缺陷中的作用及其在Akt3–FoxO1通路中的机制。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）临床样本收集：来自浙江大学医学院附属妇产科医院的AMA女性（35–45岁，因难免流产行人工流产）和年轻女性（20–30岁，因社会原因终止妊娠）的蜕膜标本，以及增生期子宫内膜样本用于分离原代人子宫内膜基质细胞（hESCs）；2）体外蜕膜化诱导：使用含甲羟孕酮乙酸酯（MPA）、环磷酸腺苷（cAMP）和β-雌二醇（E2）的激素混合物处理hESCs 4天，通过形态学评估和RT-qPCR检测蜕膜标志物（PRL和IGFBP1）确认成功；3）基因敲除与敲低：采用siRNA瞬时转染和shRNA慢病毒转导在hESCs中敲低RICTOR，以及构建子宫特异性Rictor条件性敲除（Rictor^d/d）小鼠；4）体内实验：包括胚胎移植模型（将年轻供体囊胚移植到年轻或老龄假孕受体）、人工蜕膜化诱导（卵巢切除后激素处理并子宫内注射芝麻油）、以及RICTOR激动剂MHY1485处理老龄小鼠；5）转录组学分析：对Rictor^f/f和Rictor^d/d小鼠蜕膜组织进行RNA测序（RNA-seq）及差异表达基因的GO和KEGG富集分析；6）分子与组织学分析：免疫荧光（IF）和Western blot检测FoxO1亚细胞定位，免疫组化（IHC）评估RICTOR表达。

**研究结果**

**3.1 老龄雌性蜕膜化受损**
通过胚胎移植模型，研究人员发现将年轻供体囊胚移植到老龄受体后，着床率和蜕膜化水平显著降低，流产和胚胎吸收率升高。人工蜕膜化诱导实验显示，老龄小鼠子宫对芝麻油刺激的蜕膜反应明显减弱，蜕膜标志物dPRP和Bmp2a表达诱导不足。从年轻和AMA女性分离的hESCs体外诱导蜕膜化后，年轻细胞呈现典型形态变化（增大、变圆、多核），并显著上调IGFBP1和PRL；而AMA细胞形态变化受损，IGFBP1表达无显著增加，PRL仅轻度上升。结果表明AMA存在内在子宫缺陷，导致蜕膜化受损和胚胎着床障碍。

**3.2 AMA女性蜕膜中RICTOR表达降低**
Western blot分析显示，与年轻对照组相比，AMA女性蜕膜组织中RICTOR蛋白水平显著下降，而RAPTOR（mTORC1关键组分）表达无变化。免疫组化进一步证实RICTOR主要定位于蜕膜基质细胞，且在AMA组中显著下调。

**3.3 RICTOR缺失损害hESCs体外蜕膜化**
通过siRNA瞬时敲低hESCs中RICTOR，细胞在体外蜕膜化诱导后形态变化明显受损。使用特异性RICTOR抑制剂JR-AB2-011处理年轻hESCs，蜕膜化能力随浓度升高而逐步降低；而用RICTOR激动剂MHY1485处理AMA hESCs，则显著挽救蜕膜化缺陷，表现为蜕膜形态细胞比例增加及IGFBP1和PRL mRNA表达升高。慢病毒shRNA稳定敲低RICTOR进一步验证了这些结果。

**3.4 子宫特异性Rictor缺失独立于胚胎因素损害蜕膜化**
为排除胚胎信号影响，研究人员构建了子宫特异性Rictor条件性敲除小鼠（Rictor^d/d）。人工蜕膜化诱导后，Rictor^d/d小鼠子宫未能发生蜕膜化，而对照小鼠（Rictor^f/f）出现显著肿胀。RNA-seq分析显示Rictor缺失后差异表达基因显著富集于FoxO、PI3K-Akt和cAMP信号通路，以及衰老、cAMP应答和蜕膜化过程。Western blot进一步证实Y→A胚胎移植组蜕膜中PI3K、Akt3、Rictor和FoxO1蛋白表达下调。

**3.5 RICTOR缺失损害hESCs中FoxO1核输出**
免疫荧光和Western blot显示，在AMA hESCs中FoxO1显著核积累，提示核输出缺陷。在年轻hESCs中敲低RICTOR后，同样观察到FoxO1核滞留，模拟了衰老细胞表型。这表明RICTOR通过调控FoxO1核质穿梭影响蜕膜化。

**3.6 RICTOR激活在体内挽救年龄相关蜕膜化缺陷**
用RICTOR激动剂MHY1485预处理老龄小鼠，显著提高了胚胎着床率和蜕膜化水平，并增加了蜕膜标志物dPRP和Bmp2a的表达。H&E染色显示MHY1485处理组蜕膜化细胞比例显著升高，伴随FoxO1核输出增强。这些结果表明，增强Rictor活性足以挽救年龄相关蜕膜化失败并改善体内妊娠结局。

**讨论与结论**

本研究证实，蜕膜中RICTOR下调导致老龄雌性蜕膜化受损。通过子宫特异性Rictor敲除小鼠模型，研究人员确认Rictor缺失独立于胚胎因素破坏蜕膜化。整合转录组和分子分析揭示了Akt3–FoxO1通路在此过程中的关键作用，特别是FoxO1核输出受损。重要的是，Rictor激动剂MHY1485治疗可显著挽救老龄小鼠的蜕膜化缺陷并提高着床率。此前研究表明，mTOR通路是衰老的关键调控因子，但其在蜕膜衰老中的作用尚不清楚。本研究发现，AMA女性蜕膜中总mTOR和磷酸化mTOR也下调，但RAPTOR未变，而RICTOR显著减少，提示RICTOR在年龄相关蜕膜化失败中起主导作用。FoxO1是蜕膜化的关键转录因子，其核输出受阻会阻碍蜕膜化进程。研究人员发现，RICTOR缺失导致p-Akt3（Ser473）下调，FoxO1核积累，为RICTOR缺失与AMA蜕膜化障碍提供了机制联系。MHY1485作为经典的RICTOR通路药理激活剂，已报道可挽救视网膜血管生成异常等，本研究首次证明其可逆转生殖衰老。因此，RICTOR诱导的Akt3-FoxO1信号对蜕膜化至关重要，RICTOR在衰老蜕膜中发挥关键作用，其激动剂MHY1485可能成为缓解衰老蜕膜负面影响、改善AMA妊娠结局的有前景策略。研究结论：RICTOR/Akt3/FoxO1通路是正常蜕膜化所必需的；衰老子宫中RICTOR缺失导致生育力下降；用MHY1485激活RICTOR可有效挽救年龄相关蜕膜化缺陷，为改善AMA妊娠结局提供了潜在治疗策略。该论文发表在《Aging Cell》。