胸腺微环境塑造TCR库中与年龄相关的定性变化

《Aging Cell》：The Thymic Microenvironment Shapes Age-Related Qualitative Changes in the TCR Repertoire

　　

衰老会损害免疫功能，增加对感染、自身免疫和炎症的易感性。胸腺在儿童期发生退化，胸腺细胞和胸腺上皮细胞（TEC）数量下降。鉴于适应性免疫依赖于T细胞通过其独特的T细胞受体（TCR）识别多样抗原，TCR库（TCR repertoire）组成中与年龄相关的精确变化是理解免疫的关键。为了研究年龄对胸腺TCR库的影响，研究人员对来自4周龄、12月龄和18月龄小鼠的发育定义的胸腺细胞群体，以及从氢化可的松治疗中恢复的胸腺细胞和接受RAG1缺陷胸腺移植的无胸腺受体的TCRα和TCRβ转录本进行了测序。与年轻胸腺相比，18月龄胸腺选择的TCR库在VxJ和CDR3 k-mer使用上具有独特模式，表明其具有不同特异性的定性不同的库。它还选择了多样性较低、扩增克隆较多的TCRβ库。在氢化可的松治疗恢复后，4周龄和12月龄胸腺都显示出对胎儿样3′TRAVx5′TRAJ重排的偏向，但12月龄胸腺还产生了多样性较低且分布不均匀的TCRβ库，在CD4^?CD8^?CD25⁺CD44^?细胞内TCRβ⁺阶段TCRβ克隆扩增增加，TRBJ-1簇使用增加，以及VxJ组合使用的独特模式。将老年RAG1缺陷胸腺移植到无胸腺裸鼠受体中，产生的TCR库与年轻移植产生的相比，多样性更低、分布更不均匀，且VxJ组合使用不同。综合研究人员的实验表明，老年胸腺产生的TCR库在定性上与年轻胸腺不同，且胸腺的非淋巴细胞区室对这些变化以及TCR库多样性与年龄相关的下降有显著贡献。

**研究背景与问题**
衰老损害免疫系统功能，增加对病原体的易感性、降低疫苗应答，并促进自身免疫和炎症。胸腺是T细胞发育的唯一淋巴器官，由发育中的T细胞（胸腺细胞）和基质细胞（包括胸腺上皮细胞（TEC）、成纤维细胞等）组成。幼年时胸腺退化，胸腺细胞和TEC数量下降，减少整体T细胞输出。然而，胸腺功能在整个生命期仍至关重要，胸腺切除会损害免疫健康。老年时，适应性免疫应答减弱、自身反应性T细胞增加，部分归因于胸腺功能障碍。T细胞受体（TCR）库的多样性是适应性免疫的基础，但衰老对胸腺内TCR库的定性影响（不仅是多样性下降，还包括特异性变化）尚不清楚。此外，胸腺非淋巴细胞区室（如TEC）在年龄相关TCR库变化中的作用也未被充分阐明。因此，本研究旨在系统比较年轻和老年小鼠胸腺中发育定义的胸腺细胞群体的TCRα和TCRβ库，揭示年龄导致的定性变化，并区分造血区室与非淋巴区室的贡献。论文发表在《Aging Cell》。

**关键技术与方法**
研究人员使用流式细胞术（FACS）分选来自C57BL/6小鼠（4周龄、12月龄、18月龄）的胸腺细胞亚群：CD3^?/lo双阳性（DP）、CD3^+/hiDP、CD4⁺单阳性（SP4）和CD8⁺单阳性（SP8）。通过TCR测序（含UMI标记）获取TCRα和TCRβ转录本，并采用Decombinator v3.1进行错误校正。此外，进行氢化可的松（HC）处理以同步胸腺细胞发育，并在第6天分析恢复期胸腺细胞。还通过将年轻（2周龄）和老年（12月龄）RAG1缺陷GFP⁺胸腺移植至裸鼠（FoxN1突变）受体，评估胸腺微环境（非淋巴区室）的贡献。数据分析包括Shannon熵、Gini指数、主成分分析（PCA）及VxJ组合和CDR3 k-mer频率分析。

**研究结果**
**2.1 老年胸腺的TCR库在多样性、分布、CDR3长度和特异性上不同于年轻成年胸腺**
通过比较3个年龄组胸腺细胞亚群的TCRβ和TCRα库，发现18月龄胸腺的CD3^+/hiDP、SP4和SP8群体中Shannon熵显著低于4周龄，Gini指数更高，表明多样性降低、分布不均匀。老年胸腺中TCRβ克隆扩增比例增加（前0.1%最丰富序列占比更高），且CDR3长度缩短。CDR3氨基酸三联体（k-mer）频率的PCA分析显示，18月龄的TCRβ和TCRα库在PC1上明显与4周龄分离，表明老年胸腺选择的TCR库具有定性不同的特异性。

**2.2 老年胸腺产生与年轻胸腺定性不同的TCR库**
热图聚类显示，TCRβ的V基因使用按细胞类型（SP4 vs SP8）聚类，而J基因使用（TRBJ）按年龄聚类：老年（12月龄和18月龄）胸腺偏向TRBJ1簇基因，年轻胸腺偏向TRBJ2簇。VxJ组合的PCA分析中，β链库按细胞类型在PC1上分离，按年龄在PC2上分离；α链库也按年龄分离。对SP4和SP8单独进行PCA，进一步证实年龄相关差异独立于细胞类型。这表明老年胸腺在库选择过程中产生了不同VxJ组合和特异性的TCR库。

**2.3 衰老降低细胞类型（MHC限制）对组合VxJ基因使用的影响**
对每个年龄组单独进行β链VxJ PCA，发现4周龄时PC1（45.3%变异）按MHC限制（SP4 vs SP8）分离，而18月龄时PC1仅解释34.7%变异，且CD3^+/hiDP与SP群体分离更明显，提示MHC限制对β链库的影响随年龄减弱。α链中MHC限制的影响也略有下降（从23.4%降至20.4%）。

**2.4 氢化可的松处理恢复期间年轻和老年胸腺产生不同的库**
HC处理6天后，12月龄胸腺的CD3^?/loDP和CD3^+/hiDP群体中TCRβ库的TRBJ1:TRBJ2比值高于4周龄，且VxJ组合的PCA显示4周龄与12月龄样本在PC1上分离。α链方面，两个年龄组均偏向胎儿样3′TRAV-5′TRAJ重排，但12月龄的VxJ组合与未处理对照相比，更多3′TRAV-5′TRAJ组合增加、5′TRAV-3′TRAJ组合减少，且该偏向在阳性选择后减弱。

**2.5 氢化可的松处理后老年胸腺的TCR库多样性降低且CDR3 k-mer使用独特**
HC处理6天后，12月龄胸腺的TCRβ和TCRα库Shannon熵均低于4周龄，且扩增克隆占比更高。CDR3 k-mer频率的PCA显示12月龄样本在PC1上主要位于负轴，与4周龄分离，表明CDR3特异性差异。HC处理3天后，12月龄胸腺的DN3群体中细胞内TCRβ^hi+细胞比例与4周龄相似，但DN4中比例更低，且DN3中CD71⁺细胞比例更高，提示早期克隆扩增增加。

**2.6 胸腺微环境对TCR库多样性与年龄相关下降的贡献（胸腺移植实验）**
将老年（12月龄）RAG1缺陷胸腺移植至裸鼠受体后，外周CD4⁺和CD8⁺T细胞比例、TCRα和TCRβ库的Shannon熵均低于年轻（2周龄）移植受体，且扩增克隆比例更高、非生产性重排比例更高。老年移植受体中，个体间CDR3共享（Jaccard指数）更低。基因使用热图显示TRAV和TRBV按细胞类型聚类，而TRBJ和TRAJ按供体年龄聚类，但未观察到老年移植中TRBJ1偏向，提示该偏向依赖于造血区室。

**2.7 胸腺微环境年龄影响移植后裸鼠受体中产生的TCR库**
将移植受体库与新鲜胸腺库进行VxJ PCA，β链中新鲜胸腺和年轻移植受体库按细胞类型分离，而老年移植受体库未按细胞类型分离且分散。α链中新鲜胸腺和年轻移植受体库主要位于PC1负轴，而老年移植受体库分散于正轴，表明老年胸腺微环境导致库选择失调，细胞类型影响减弱。

**讨论与结论**
本研究揭示了年轻成年与老年胸腺在TCR库多样性、分布、克隆性、CDR3长度、VxJ及CDR3 k-mer使用上的显著差异。老年胸腺产生定性不同的TCR库，这种变化可能解释年龄相关免疫下降的新机制。克隆扩增部分源于胸腺内发育过程中的早期扩增（如HC恢复实验中的DN3阶段）。胸腺移植实验表明，非淋巴区室（尤其是TEC）对库多样性和选择偏倚有重要贡献，而TRBJ1偏向则依赖于造血区室。老年胸腺中TEC数量减少、功能下降（如自身免疫调节因子AIRE表达、肽加工和MHC-肽复合物呈递改变）可能影响库选择。稳态下12月龄胸腺表型与4周龄相似，但HC处理后在恢复期间表现出差异，提示在应激或化疗等扰动下，老年胸腺可能产生定性不同的库。研究结论：综合研究人员的实验表明，老年胸腺产生的TCR库在定性上与年轻胸腺不同，且胸腺的非淋巴细胞区室对这些变化以及TCR库多样性与年龄相关的下降有显著贡献。