衰老改变迟发性年龄相关性听力损失小鼠毛细胞的生理特性

《Aging Cell》：Aging Alters Hair Cell Physiological Properties in Mice With Late-Onset Age-Related Hearing Loss

　　

哺乳动物的耳蜗毛细胞将声刺激转化为电信号，这些电信号通过听觉神经元传递到中枢听觉通路。毛细胞及其突触的逐渐丧失是年龄相关性听力损失（ARHL）的特征，但其潜在机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员测试了假设：在CBA/CaJ小鼠（一种以缓慢ARHL进展而闻名的品系）中，毛细胞生理特性随年龄变化。研究人员发现，毛细胞大小从10月龄开始减小，远早于听性脑干反应（ABR）可检测到的听力阈值升高。这种结构变化与基底外侧膜电流的显著减小相关，特别是由顶圈内毛细胞（IHCs）中的大电导钙激活钾（BK）通道电流（I_K,f）携带的电流。然而，在IHCs中测量的机械电转导（MET）电流的大小至少在22月龄前仍保持不变。研究人员的结果为顶圈IHCs生理特性随年龄的早期变化提供了明确证据，这种变化先于可测量的听力损失，表明这些细胞缺陷可能定义了CBA/CaJ小鼠中一种独特的病理途径。

年龄相关性听力损失（ARHL）是影响60岁以上人群三分之一的常见疾病，其机制复杂，涉及螺旋神经节神经元退化和耳蜗感觉毛细胞丢失。不同小鼠模型（如早发C57BL/6N和迟发CBA/CaJ）表现出不同的进展速度，但毛细胞生理特性如何随年龄变化尚不清楚。本研究旨在验证CBA/CaJ小鼠（一种迟发性ARHL模型）中毛细胞功能退化的假说。研究人员使用全细胞膜片钳电生理学、免疫荧光显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和定量实时PCR（qRT-PCR）等技术，系统分析了不同年龄组（1、9–11、16–18、20–23月龄）CBA/CaJ小鼠耳蜗顶圈（9–12 kHz区域）毛细胞的生理特性。研究得出以下结论：毛细胞大小和膜电容（C_m）从9月龄开始显著减小，早于听力阈值升高；内毛细胞（IHCs）中快速激活的大电导钙激活钾（BK）通道电流（I_K,f）密度随年龄下降，而IK,n和机械电转导（MET）电流维持不变；IHCs静息膜电位（V_m）去极化；传出纤维重新支配IHCs。这些发现发表在《Aging Cell》上，表明毛细胞生理退化是ARHL的早期关键步骤，为迟发性听力损失的治疗干预提供了新靶点。

**主要关键的技术方法（不超过250字）**：本研究使用CBA/CaJ小鼠（来源：商业供应商，未具体说明品系来源），样本按年龄分为1、9–11、16–18、20–23月龄组。主要技术包括：①全细胞膜片钳记录，从耳蜗顶圈9–12 kHz区域分离毛细胞，测量电压门控钾电流（I_K、I_K,f、I_K,n）和MET电流，以及电流钳下的电压响应；②听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）分别评估听力阈值和外毛细胞功能；③扫描电子显微镜（SEM）观察毛细胞束形态；④免疫荧光显微镜，使用抗MYO7A（毛细胞标记）、CtBP2（突触带）、BK通道、SK2（小电导钙激活钾通道）和ChAT（胆碱乙酰转移酶，传出神经元标记）抗体，通过共聚焦成像定量分析；⑤定量实时PCR（qRT-PCR）检测BK通道亚基Kcnma1和Lrrc52的mRNA表达。

**研究结果**：

**2.1 CBA/CaJ小鼠随年龄出现轻度听力损失**：通过ABR测量，发现21–23月龄小鼠仅对click和36 kHz纯音刺激的阈值升高（p<0.05），而12 kHz处波1振幅显著下降（p<0.001），但潜伏期无变化。DPOAE阈值在各年龄无差异。内毛细胞（IHCs）中突触带（CtBP2）数量随年龄减少（p<0.001），表明存在隐藏性听力损失。

**2.2 顶圈毛细胞随年龄变小**：通过MYO7A染色计数，在100 μm顶圈区域未发现毛细胞数量显著丢失（OHC p=0.721，IHC p=0.942）。但膜电容（C_m）测量显示，IHC和OHC从9月龄起显著减小（IHC: 9–11月 p=0.005，16–18月 p=0.023，20–23月 p=0.004；OHC: 9–11月 p<0.001，16–18月 p<0.001）。共聚焦图像体积量化也证实IHCs体积减小（p=0.009）。

**2.3 顶圈IHCs的K⁺电流随年龄变小**：全细胞膜片钳记录显示，IHCs和OHCs的总稳态K⁺电流（I_K）在0 mV处显著减小（IHC: 1月 vs. 9–11月 p=0.044，vs. 16–18月 p=0.038；OHC: 1月 vs. 16–18月 p=0.014）。但电流密度（I_K/C_m）无显著变化，表明电流减小与细胞缩小相关。然而，I_K,f（在?25 mV处测量）的电流密度显著下降（I_K,f/C_m，p<0.001），而I_K,n无变化。通过BK通道阻断剂TEA和IbTX确认I_K,f由BK通道介导，且TEA敏感电流和IbTX敏感电流均随年龄减少（p<0.001）。qRT-PCR显示Kcnma1和Lrrc52 mRNA表达在1月与9月间无显著变化（p=0.726）。免疫染色显示，BK通道蛋白总量和单个punctum体积在CBA/CaJ、C3H/HeJ和C57BL/6N衰老小鼠中均减少，但punctum数量仅在C3H/HeJ和C57BL/6N中减少（CBA/CaJ中不变，p>0.999），表明CBA/CaJ中BK通道减少主要源于每个punctum的蛋白表达降低。

**2.4 衰老的顶圈IHCs有更去极化的电压反应**：电流钳记录显示，IHCs的静息膜电位（V_m）随年龄显著去极化（1月 vs. 16–18月 p=0.007），而OHCs无变化（p=0.191）。在0.9 nA电流注入下，IHCs的峰值电压响应更高（1月 vs. 9–11月 p=0.008，vs. 16–18月 p=0.006），OHCs无变化（p=0.484）。

**2.5 顶圈IHCs的机械电转导（MET）电流维持不变**：SEM显示毛细胞束形态无异常。流体喷射刺激记录MET电流，最大电流大小（p=0.549）和静息开放概率（p=0.591）在1、17、22月龄间无显著变化。

**2.6 传出纤维重新支配衰老IHCs**：免疫染色显示，CBA/CaJ小鼠中SK2和ChAT阳性传出纤维接触的IHCs比例随年龄增加（1月 vs. 21–23月 p<0.001），但SK2 punctum数量低于C3H/HeJ（p<0.001）和C57BL/6N（p=0.028），与6N-Repaired无显著差异（p=0.076）。提示传出纤维重新支配普遍存在于不同ARHL模型中，可能由一般老化过程驱动，而非MET缺陷所致。

**讨论与结论**：研究人员发现，衰老CBA/CaJ小鼠毛细胞的关键变化包括细胞缩小、BK通道电流减少和传出纤维重新支配，这些变化先于听力阈值升高，表明毛细胞功能退化是ARHL的早期病理事件。BK通道的减少可能损害毛细胞复极化，影响声音的时间处理精度，从而参与隐藏性听力损失。尽管MET电流维持正常，但基底外侧电流减少导致IHCs静息膜电位去极化，可能改变其工作范围。不同小鼠品系间传出纤维重新支配的差异强调遗传背景对听觉老化的影响。总结而言，研究人员的研究表明，衰老CBA/CaJ小鼠毛细胞经历进行性功能退化，作为听觉老化病理的关键步骤，为迟发性ARHL的早期干预提供了潜在靶点（BK通道）。