综述：植物基食品研究中 INFOGEST 2.0 协议的方法学修改：一项系统综述

《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Methodological Modifications of the INFOGEST 2.0 Protocol in Plant-Based Food Studies: A Systematic Review

　　

INFOGEST 2.0 协议作为一种标准化的静态体外消化模型被广泛应用，近年来其在涉及植物基食品研究中的应用大幅增加。研究人员旨在识别、分类并批判性评估在研究植物基食品和补充剂时应用于 INFOGEST 2.0 协议的方法学修改。研究人员在 ScienceDirect、Scopus 和 PubMed 数据库中进行了系统性检索，共识别出 119 篇发表于 2019 年至 2024 年间的原创研究文章。根据所改变的参数及其潜在原理，提取并分析了跨越口腔、胃和肠道阶段的方法学修改。大约一半的研究 (50.4%) 偏离了标准化的 INFOGEST 条件，特别是在酶活性、pH、胆汁浓度和消化时间方面。重要的是，这些适应性调整并非完全由食品基质的植物基特性所驱动，也反映了与研究人群或目标相关的方法学因素，包括与衰老相关的生理条件、特定实验需求、特定化合物（如矿物质和酚类化合物）的追踪以及空白扣除。尽管此类修改可能增强生理相关性或分析准确性，但它们也引入了与跨研究可比性之间的权衡，凸显了对更清晰的报告规范和基于共识的 INFOGEST 框架扩展的需求，以平衡生理相关性与方法学一致性。

1 Introduction (引言)
INFOGEST协议是一项国际协调的静态体外消化方法，旨在以具有生理相关性和可重复性的方式模拟人类胃肠道条件。该协议于2014年通过国际科学共识首次发布，旨在统一体外消化程序并提高实验室内和实验室间研究的可重复性。它标准化了每个消化阶段的关键实验参数，包括酶活性、pH值、电解质组成和消化时间，从而使研究营养消化率的研究之间具有更大的一致性和可比性。2019年，修订后的INFOGEST 2.0协议发布，通过纳入口腔阶段、胃脂肪酶和最佳试剂建议等更新来完善原始方法，以更好地模拟人类消化。随着植物基食品和补充剂领域的快速扩张，INFOGEST的重要性不断增加。在营养、环境和消费者健康动机的驱动下，植物基产品已在肉类类似物、饮料、面粉、蛋白质分离物和强化补充剂等类别中实现了多样化。市场分析表明，全球和区域需求持续增长，预计到2030或2031年全球植物基市场价值将大幅提高。然而，比较各植物基研究的消化结果仍具有挑战性。这部分困难与植物基质的结构和生化复杂性有关，包括纤维含量、细胞壁完整性、蛋白质聚集和抗营养化合物等因素，这些因素会影响蛋白质水解和营养素的释放。此外，实验目标、目标人群和方法学选择的差异可能导致研究人员调整特定的INFOGEST 2.0条件，进一步影响结果的可比性。因此，本系统综述的目的是识别、分类和批判性分析在评估植物基食品和补充剂研究中应用于静态INFOGEST 2.0协议的方法学修改，并解释这些偏差背后的动机及其对生理相关性和可重复性的影响。

2 Material and Methods (材料与方法)
研究人员在ScienceDirect、Scopus和PubMed数据库中进行了系统性检索，使用关键词“INFOGEST”和“PLANT-BASED”来识别相关文章。检索应用于所有文档部分，并限于2019年至2024年的原创研究文章，初步识别出239篇文章。筛选过程从评估标题和摘要开始。在此阶段，排除了重复文章、非开放获取文章、综述文章以及与动物基食品相关的研究。然后通过全文阅读对剩余文章进行评估。在此阶段，排除了使用非INFOGEST体外消化协议的研究以及未遵循静态INFOGEST 2.0协议（如半动态或动态模型）的研究。应用这些标准后，119篇使用静态INFOGEST 2.0协议研究植物基食品或补充剂消化的研究文章被纳入本综述。文献检索和选择过程遵循PRISMA方法。根据应用于消化协议的方法学修改数量对分析的研究进行分类。为清晰起见，将研究分为四类（一项、两项、三项和四项及以上修改）。

3 Results and Discussion (结果与讨论)

3.1 Main Modifications (主要修改)
INFOGEST协议作为一种标准化的体外消化方法出现，旨在促进不同研究间结果的比较。因此，研究人员强烈建议在原始出版物中描述的相同实验条件下应用该协议以确保可重复性。自2014年发布第一版以来，INFOGEST协议经历了持续修订，最终于2019年发布了第二版(INFOGEST 2.0)。然而，本次综述涵盖的研究发表于2019年至2024年间，在此期间，针对某些生理条件的特定标准化适应方案仍在发展中。例如，在针对老年人年龄适应的INFOGEST协议提出之前，多项研究已经引入了修改以模拟老年人的消化。在针对老年人提出适应年龄的协议之后，预计未来的研究将更一致地采用该协议，从而提高专注于老年人的研究之间的可比性。近期的研究扩展了静态INFOGEST 2.0协议，标准化了测定膳食蛋白质消化率和消化率必需氨基酸评分(DIAAS)的体外方法，同时考虑了可溶性部分（上清液）和不溶性部分（沉淀）。在本次综述中，大约一半的研究严格遵循了静态INFOGEST 2.0协议，而其余研究在包括口腔、胃和肠道阶段的一个或多个消化阶段引入了修改。这些适应性与不同的方法学原理相关，特别是模拟特定生理条件或解决特定实验目标的需要。虽然一些修改与植物基食品基质的结构和组成特征有关，但大多数是为了更好地代表特定的消化场景，特别是涉及老年人的场景。因此，本综述中识别的方法学适应根据其发生的消化阶段（口腔、胃或肠道）进行了分类。这些修改的频率和类型突出了口腔和胃阶段修改的普遍性。

3.1.1 Oral Phase (口腔阶段)
在生理上，消化过程从口腔开始，唾液分泌含有α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)的唾液。该酶催化多糖中内部α-1,4-糖苷键的水解，产生D-葡萄糖、麦芽糖、寡糖和糊精。为了密切模拟口腔的生理条件，INFOGEST协议建立了需要遵循的特定参数。在口腔阶段观察到的主要修改包括使用替代来源的α-淀粉酶、改变酶活性、使用人类志愿者进行口腔阶段、仅使用水、添加黏蛋白、增加液体或样品比例以及孵育时间的变化。INFOGEST协议允许选择性加入α-淀粉酶，建议在消化含淀粉食品时使用。使用替代来源的α-淀粉酶（如微生物来源的芽孢杆菌属）由于生化差异（人类唾液α-淀粉酶作为内切淀粉酶起作用，而微生物α-淀粉酶通常作为外切淀粉酶起作用）会影响消化谱，从而损害研究间结果的可比性和解释。酶活性的变化可以显著影响口腔阶段的消化过程。一些研究采用了酶浓度的调整，以更好地模拟特定生理条件，特别是与老年人群相关的生理条件，其中与年龄相关的功能性衰退会影响消化过程。另一项修改是使用人类志愿者进行口腔阶段。由于必须通过模拟咀嚼将固体食物样品分解成小颗粒，且协议建议使用人类唾液α-淀粉酶，因此体内进行口腔阶段似乎是一种有吸引力的方法。然而，在这些研究中，酶活性通常无法直接测量或标准化，这引入了额外的变异性来源。此外，模拟的口腔阶段在INFOGEST协议中标准化为2分钟。以更短或不受控制的持续时间进行可能会损害实验室条件下结果的准确性和可重复性。

3.1.2 Gastric Phase (胃阶段)
在口腔阶段之后，食团被吞咽，消化过程在胃中继续。模拟胃阶段涉及添加模拟胃液(SGF)、消化酶（胃蛋白酶和胃脂肪酶）以及特定的酸性环境，以复制最佳酶活性所必需的生理条件。在胃阶段观察到的主要修改包括省略胃脂肪酶、改变胃蛋白酶活性、改变pH值以及孵育时间的变化。根据修订后的INFOGEST协议，建议纳入胃脂肪酶，因为脂质消化从胃开始。然而，尽管有此建议，一些研究在消化程序中省略了胃脂肪酶，这可能是由于实际限制（如市售胃脂肪酶的可用性有限）以及研究的特定重点。在主要针对蛋白质、碳水化合物、肽或酚类化合物的研究中，胃脂肪酶可能被认为不那么关键。观察到的另一项修改是胃蛋白酶活性的降低。这些调整通常是为了更好地代表特定人群（特别是老年人）的胃消化，这些人群与年龄相关的生理变化可能会影响消化功能。较低的胃蛋白酶活性被用于重现随着年龄增长而观察到的胃分泌能力下降。这些修改可能显著影响蛋白水解效率和消化动力学。胃阶段pH的修改也会显著影响消化结果。在体内，胃pH是动态的。尽管如此，INFOGEST协议建议在胃阶段保持恒定的pH值，以确保最佳的酶活性和可靠的消化结果。一些研究还修改了孵育时间。标准化协议建议成人胃阶段孵育2小时。然而，一些作者增加了孵育时间以更好地反映老年人的胃排空，因为该人群的胃转运往往较慢。

3.1.3 Intestinal Phase (肠道阶段)
消化过程在肠道阶段继续，在此期间，酸性的胃食糜被中和以匹配小肠的生理pH。肠道阶段涉及添加模拟肠液(SIF)、胆汁盐、消化酶（胰酶）并建立中性pH环境。在INFOGEST协议中，研究人员可以选择使用胰酶（一种标准化的酶混合物）或单独的纯化酶来模拟消化的肠道阶段。在肠道阶段识别的主要修改包括改变胰酶活性、调整pH、孵育时间的变化以及胆汁盐浓度的变化。一项常见的修改是改变胰酶活性，特别是胰酶混合物中胰蛋白酶的活性。一些作者调整了胰蛋白酶活性，与推荐的协议值相比有所降低。这些改变通常是为了适应体外消化模型，以更好地反映老年人胃肠道酶活性降低的情况。同样，报告了pH值的修改，变化在pH 6.5和7.5之间。观察到了孵育时间的变化，一些作者将肠道阶段的持续时间延长至3至4小时。这种调整旨在模拟老年人常见的较慢肠道转运时间。此外，与协议标准的10 mM相比，胆汁盐浓度通常被降低。在几项研究中，胆汁盐水平范围为1至8.7 mM，一些降低是为了模拟与年龄相关的胆汁产生和分泌下降。在其他情况下，使用较低的胆汁盐浓度是为了改善消化物对肠道细胞培养测定的生物相容性，因为高胆汁盐水平可能对上皮细胞产生细胞毒性。上皮细胞被广泛用作人类肠上皮的体外模型，有助于评估消化过程中释放的氨基酸和矿物质等营养素是否可用于细胞摄取和转运。这些适应反映了提高特定人群（如老年人）生理相关性的努力，但它们可能会降低严格遵循INFOGEST协议的研究间发现的可重复性和可比性。

3.2 Other Modifications (其他修改)
为满足特定实验需求，对协议引入了其他修改。在两项研究中，通过测量胰酶溶液上清液中的胰蛋白酶活性来修改测定胰酶酶活性的方法。在分析食物样品中矿物质（包括铁、钙和氮(¹⁵N)）的生物可及性时，向模拟消化液中添加了稳定同位素。具体而言，对模拟唾液、胃、胰液和胆汁液进行了标记，以作为试剂来源铁的示踪剂。这种修改允许对食物样品固有的铁与消化试剂（如胃蛋白酶、胰酶和牛胆汁）中存在的残留铁进行定量区分，否则可能会导致生物可及性的高估。同样，使用内源¹⁵N标记的面筋和酪蛋白来区分膳食氮和主要来源于胰酶和胆汁的内源性氮。此外，在口腔阶段，一些作者加入了黏蛋白，这是人类唾液中天然存在的唾液糖蛋白，在润滑、薄膜形成和抗菌防御中起着关键作用。然而，黏蛋白是唾液的次要成分，因此被排除在原始INFOGEST协议之外。针对特定基质的修改，如在丝状真菌生物质中，研究人员降低了胰酶和唾液淀粉酶活性，并从模拟消化液中排除了碳酸铵(NH₄CO₃)，以最小化基于OPA的水解度测定中试剂来源一级胺的干扰。在植物基汉堡的胃阶段补充菊粉酶显著增强了果聚糖的水解。在研究植物甾醇消化时引入胆固醇酯酶，并用部分脱水的面包替代体内咀嚼以减少变异性。固体和复杂的植物基质通常需要特定的制备策略（如控制尺寸减小、标准化研磨和预处理）以确保均匀性和可重复性。在乳化和植物基奶昔基质中，结合pH-stat监测和高压均质化以更好地表征脂解动力学和界面消化现象。在评估矿物质和酚类化合物时，应用透析膜和空白校正以完善肠道生物可及性估计并最小化分析干扰。

4 Conclusion (结论)
本系统综述表明，在研究植物基食品和补充剂时，静态INFOGEST 2.0协议的方法学适应被广泛应用。然而，在大多数情况下，这些适应并非本质上与基质的植物基特性相关。相反，它们源于两个不同的方法学驱动因素：为解决特定研究设计相关的分析和实验要求而引入的调整，以及为模拟特定生理环境（最显著的是与衰老相关的环境）而进行的适应。认识到这一区别对于避免对植物基消化研究中的方法学变异性进行过度简化的解释至关重要。尽管此类适应可以增强生理相关性，特别是针对特定人群或研究目标时，但它们不可避免地会引入与跨研究可比性的权衡。对共识参数的修改可能会显著影响消化结果，并在偏差未得到充分证实或报告不一致时掩盖真实的基质效应。因此，研究结果表明，需要更清晰的报告规范和基于共识的INFOGEST框架扩展，以平衡生理相关性与方法学一致性。