评估地表水中可存活病原体的数量：基于PMA的全长16S rRNA基因测序与传统方法的比较

《Microbial Risk Analysis》：Assessing viable pathogen loads in surface water: a comparison between PMA-based full-length 16S rRNA gene sequencing and conventional methods

　　

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  PMA预处理有效抑制了死亡细胞的信号。
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  通过PMA-FL-16S绝对测序，存活细菌的比例为12.9–90.8%。
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  PMA-FL-16S绝对测序在约30%的样本中错过了目标病原体。
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  PMA-FL-16S的丰度与传统结果相关，尽管数值较低。

引言

基于定量微生物风险评估（QMRA）的有效水资源管理严重依赖于关于存活（具有传染性）病原体浓度的准确数据。这凸显了评估和验证能够准确检测和量化这些病原体方法的关键需求。对于细菌病原体，传统的检测方法是开发QMRA的首选数据来源。基于培养的和定量PCR（qPCR）的方法被广泛使用，其中基于培养的方法更受欢迎（Nguyen等，2025年）。虽然这些方法可以满足对特定目标病原体的监管要求，但它们的通量通常较低，这限制了它们同时检测多种目标病原体以及在许多应用场景中对未知危害进行全面筛查的能力。近年来，高通量测序（HTS）技术作为病原体分析的强大工具出现了，为改进检测和量化提供了新的机会。特别是，在各种HTS方法中，全长16S rRNA基因（以下简称FL-16S）测序已成为一种强有力的工具，因为它提供了更高的物种分辨率，并能够筛查水样中的多种病原体（Callahan等，2019年；Singer等，2016年；Zeng等，2025年），同时保持了性能与易用性之间的实用平衡。

两项关键进展增强了HTS在QMRA中的潜力。首先，引入内部标准实现了绝对量化（Yang等，2023年），解决了HTS方法通常依赖于相对分类单元丰度的固有局限性。其次，有效使用存活力染料（如丙啶甲酰胺（PMA）和乙锭甲酰胺（EMA）使得通过测序选择性地量化膜完整的细胞（存活病原体的代理）成为可能。PMA和EMA是能够插入DNA的染料，它们选择性地进入膜受损的细胞，并在强可见光下与双链DNA形成共价交联，从而阻止其通过PCR扩增。与EMA不同，PMA由于其正电荷，能够被完整的膜有效排除（几乎100%的存活E. coli O157:H7细胞在3-30 μM PMA处理1-15分钟后仍可检测到）（Nocker等，2006年）。PMA已被广泛用于检测存活细胞和微生物群落（Guo等，2021年；Rogers等，2013年）。然而，FL-16S测序、内部标准和PMA处理相结合用于存活病原体量化的方式仍然很少被探索。

基于PMA的HTS方法估计丰度的可靠性受到了质疑，因为之前的研究结果并未一致。例如，Yang等人（2023年）观察到通过基于PMA的纳米孔宏基因组测序获得的E. coli和Vibrio属细菌的丰度与传统基于培养的方法之间存在强相关性。然而，一些研究表明，基于PMA的方法可能不适用于活细菌的定量检测（Kaur等，2025年；Li等，2017年）。因此，需要进一步使用已知方法进行评估以验证这种新方法。此外，HTS方法产生的是基因拷贝数浓度，而QMRA剂量-反应模型通常基于菌落形成单位（CFU）。因此，需要将HTS衍生的拷贝数转换为CFU等效值（Burch等，2024年；Corsi等，2016年），以便在QMRA中应用HTS方法。

本研究旨在通过将基于PMA的FL-16S绝对量化测序（PMA-FL-16S绝对测序）与传统方法直接比较，来评估这种新方法。具体目标是：（i）评估使用内部标准序列的FL-16S绝对测序的量化性能；（ii）评估PMA处理在纯培养和环境水样中对细菌选择性量化的效果；（iii）比较PMA-FL-16S绝对测序与PMA-qPCR和培养方法在量化E. coli（肠道病原体）和Aeromonas veronii（环境机会性病原体）方面的性能，这两种细菌在环境水样中经常被检测到；（iv）对E. coli进行剂量校准。

章节片段

地表水样描述

地表水样来自中国厦门的一个淡水水库，该水库具有多种功能，包括防洪、灌溉、景观供水和娱乐用途。建立了三个采样点（即X1-X3）（图1）。样本在水面下0.5米处采集，共获得了15个水样（表1）。所有样本都在早晨采集，当时环境温度约为28-32°C。尽管期间没有下雨

FL-16S绝对测序的标准曲线

在测序前，向每个DNA样本中加入了一系列多浓度的内部标准。这种设计可以在任何一个内部标准失败时检测并纠正潜在的偏差，并提高方法对技术变化的适应性（Harrison等，2021年；Wang等，2025年）。如图2所示，所有21个DNA样本的理论 spiked-in绝对谱与测量信号之间显示出 strong 一致性，R2

讨论

检测存活病原体并准确量化其丰度是可靠QMRA的关键前提。最近的研究结合了HTS和存活力染料来解决这一需求，主要使用短读长16S测序进行相对量化（Reyneke等，2022年）和纳米孔绝对宏基因组测序（Yang等，2023年）。本研究评估了基于PMA的FL-16S绝对测序在环境地表水中评估存活病原体的应用。

结论

本研究通过直接与传统的qPCR和基于培养的方法比较，评估了PMA-FL-16S绝对测序用于存活病原体量化的效果。PMA处理有效地抑制了纯培养和环境水样中非存活细菌的DNA信号。与传统方法相比，PMA-FL-16S测序在检测E. coli和A. veronii时的假阴性率为约30%（n = 15），并且显示出强相关性

数据可用性

数据可根据请求提供。

作者贡献

J.Z.：资金筹集、概念构思、方法论、数据管理、正式分析、初稿撰写、审稿和编辑。X.C. 和 J.L.：资金筹集、资源提供。D.H. 和 X.L.：方法论、审稿和编辑。

利益冲突

作者声明没有竞争利益。

CRediT作者贡献声明

Jie Zeng：撰写——审稿和编辑、初稿撰写、方法论、资金筹集、正式分析、数据管理、概念构思。Xi Chen：资源提供、项目管理。Jingtao Liu：资源提供、项目管理。Dong Hu：撰写——审稿和编辑、方法论。Xi Li：撰写——审稿和编辑、资源提供、方法论。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了厦门海外归国人员研究项目和河北省水资源可持续利用与产业结构优化协同创新中心开放项目计划（编号：SXTCX202405）的支持。

Jie Zeng|Xi Chen|Jingtao Liu|Dong Hu|Xi Li