APTX缺乏与患者来源神经元的神经元分化改变和选择性剪接相关

《Neurobiology of Disease》：APTX deficiency is associated with altered neuronal differentiation and alternative splicing in patient-derived neurons

　　

眼球运动失用症共济失调1型（AOA1）由DNA修复蛋白aprataxin（APTX）突变引起，导致进行性神经退行性变。在本研究中，研究人员建立了AOA1患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）和神经元分化模型。研究人员证明，AOA1来源的神经元表现出神经突形态和成熟缺陷，与DNA单链断裂（SSB）信号的积累相关。在基因毒性暴露后，AOA1来源的神经元表现出更强的DNA损伤和PAR信号，以及较低的蛋白质标准化的NAD(H)和ATP。这些平行变化与代谢应激一致，但并未建立PARP1依赖的因果通路。批量转录组分析和选择性剪接（AS）分析进一步揭示了广泛的转录组失调和改变的AS事件，特别是在神经突发育和突触功能必需的神经元基因中富集。总的来说，研究人员的发现确定了AOA1患者来源培养物中的神经元分化、DNA损伤、代谢和转录组差异，并推动了APTX功能的组成控制和挽救研究。

眼球运动失用症共济失调1型（AOA1）是一种罕见的常染色体隐性遗传神经退行性疾病，由DNA修复蛋白aprataxin（APTX）基因突变引起，APTX在DNA单链断裂修复（SSBR）通路中至关重要。然而，SSBR缺陷如何导致选择性神经元脆弱性和退行性变尚不清楚。既往研究利用CRISPR/Cas9编辑的iPSC模型初步揭示了APTX缺乏与神经分化缺陷及DNA单链断裂（SSB）积累的关联，但缺乏对患者源性复杂基因型的系统分析。为深入理解AOA1的病理机制，本研究利用携带复合杂合突变（c.[602A>C(p.H201P)];[602A>G(p.H201R)]）的AOA1患者来源诱导多能干细胞（iPSC），通过分化模型系统探究APTX缺乏的后果。研究人员发现，AOA1来源的早期未成熟神经元（EiN）表现出神经突形态和成熟缺陷，伴随DNA损伤积累、聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）过度激活以及细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD(H)）和三磷酸腺苷（ATP）耗竭。批量转录组和选择性剪接（AS）分析揭示了广泛的转录组失调和异常AS事件，尤其是神经突发育和突触功能相关基因。该论文发表在《Neurobiology of Disease》，为阐明APTX功能提供新的整合框架。

**关键技术与方法**：研究从一名11岁男性AOA1患者的外周血单核细胞（PBMCs）生成iPSC（由Help Therapeutics协助），以健康成人iPSC（来自广州生物医药与健康研究院）为对照。采用改良双SMAD抑制方案将iPSC分化至早期未成熟神经元（EiN）。主要技术包括：彗星试验（碱性）评估DNA单链断裂，ELISA检测8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）评估氧化损伤，免疫荧光定量PAR信号及神经突形态，Western blot分析蛋白表达，批量RNA-seq进行转录组差异表达（DEGs）和选择性剪接（AS）分析（rMATS软件）。所有分化实验均包含至少3个独立批次。

**研究结果**：

**3.1 AOA1患者来源iPSC的生成与鉴定**：通过Sanger测序确认AOA1-iPSC保留患者复合杂合突变。APTX mRNA水平与对照组无显著差异，但APTX蛋白表达检测不到，表明该模型为“功能丧失”型。体内畸胎瘤形成和体外免疫荧光显示AOA1-iPSC保持多能性标志物（OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-4）的正常表达。

**3.2 AOA1-iPSC的神经元分化缺陷**：分化第27天，AOA1组TUJ1阳性早期未成熟神经元比例显著降低，最长神经突长度和分支点数量减少。第50天成熟神经元中，MAP2/VGLUT1双阳性（谷氨酸能）和MAP2/GAD1双阳性（GABA能）神经元比例均显著低于对照组，表明神经元成熟效率下降。

**3.3 AOA1-EiN中DNA损伤敏感性增高**：碱性彗星试验显示，在基础条件下AOA1-EiN的Olive尾矩（OTM）显著高于对照组，而神经祖细胞（NPC）阶段无差异；甲基甲烷磺酸酯（MMS）处理后，AOA1组OTM进一步升高。ELISA检测显示，叔丁基过氧化氢（TBHP）处理后，AOA1-NPC和AOA1-EiN的8-OHdG水平均显著高于对照组，提示APTX缺陷细胞对氧化应激和基因毒性应激更敏感。

**3.4 DNA损伤与PARP-1过度激活及代谢功能紊乱相关**：Western blot显示AOA1-EiN中PARP-1蛋白表达上调。在PARG抑制剂（PARGi）存在下，AOA1-EiN的内源性PAR水平升高，MMS处理后进一步增加。在TBHP或MMS处理后，AOA1-EiN的NAD(H)和ATP水平显著低于对照组，表明基因毒性应激下出现能量代谢危机。

**3.5 AOA1-EiN中神经突和突触功能基因表达失调**：批量RNA-seq鉴定出1138个差异表达基因（DEGs，|log2FoldChange|≥1，校正P<0.05），其中442个上调、696个下调。基因本体（GO）富集分析显示DEGs显著富集于神经系统发育、突触组装、化学突触传递及轴突、树突、突触前/后膜等结构。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示轴突导向、突触囊泡循环、神经活性配体-受体相互作用等通路显著富集，其中包括CAMK2、PAK、SEMA、PLXN、UNC-5等轴突导向基因家族转录失调，以及GABAR、CACNA、GRI、GRM、GAD、SLC等突触功能基因表达下调。

**3.6 AOA1-EiN中探索性差异剪接分析**：rMATS分析以FDR<0.05和|ΔIncLevel|>0.1为阈值，鉴定出432个候选差异选择性剪接事件，以外显子跳跃（SE）为主（72.69%），其次为互斥外显子（MXE，9.49%）、内含子保留（RI，6.94%）、5′剪接位点（A5SS，6.02%）和3′剪接位点（A3SS，4.86%）。这些AS宿主基因的GO富集分析显示与神经突形成、突触发生和突触结构显著相关。与DEGs重叠的20个基因中，除MAPK15上调外，其余19个均下调，功能涉及轴突导向、突触功能、细胞黏附和神经元结构组分，且主要为SE型剪接。

**讨论与结论**：研究人员指出，本研究利用患者来源iPSC模型揭示了AOA1中APTX缺乏与神经元分化缺陷、DNA损伤积累、PARP1过度激活、NAD(H)和ATP耗竭以及转录组和选择性剪接失调的关联，将AOA1的病理机制从单纯的DNA修复缺陷拓展至基因组不稳定性、生物能量应激和转录组加工的整合框架。研究同时承认局限性：仅使用单一条患者来源iPSC系，缺乏家族匹配或同基因对照；未成功实现基因纠正或功能挽救；双SMAD分化模型偏向皮质样神经元，不能完全代表小脑病理；批量RNA-seq无法区分细胞组成效应与APTX依赖的调控。未来需采用碱基编辑或先导编辑技术、小脑类器官以及高分辨率DNA损伤测序等方法进一步验证。研究结论（翻译）：总的来说，本研究确定了AOA1患者来源培养物中神经元分化、DNA损伤、代谢和转录组的差异，突出与疾病表型相关的并发生物能量应激和转录失调。这些发现推动了组成控制和挽救研究，以进一步阐明APTX功能在AOA1发病机制中的精确分子机制。