中国境内穿山甲源多重耐药大肠杆菌的进化与流行病学特征

《Integrative Zoology》：Evolutionary and Epidemiological Characterization of Multidrug-Resistant Escherichia coli Isolated From Pangolins in China

　　

马来穿山甲种群已降至极危水平，野生穿山甲的非法贩运系全球性问题。尽管穿山甲常被作为食物消费或用于传统医药，但关于其携带的耐抗菌药物细菌（MDRB）所知甚少。本研究首次报道于2018年12月在中国深圳查获的一只马来穿山甲中检出多重耐药大肠杆菌（Escherichia coli）菌株。基因组分析显示，共轭质粒上携带种类多样且丰度较高的抗生素抗性基因（ARG）。在MDR大肠杆菌分离株中，携带大量ARG及保守可移动遗传元件的IncX1型复制子质粒占主导。该类1整合子样基因簇、IS26及Tn1721等结构特征进一步强化了质粒的水平转运能力，可能促进跨物种播散。综上，研究结果表明马来穿山甲的非法跨境贩运可能助推MDRB传播，并凸显了不受控野生动物贸易相关的潜在公共卫生风险。

研究背景方面，抗菌药耐药性（AMR）因抗生素过度使用成为全球公共卫生重大威胁，人类活动加剧其复杂流行病学扩散。理论上未接受抗生素治疗的野生动物及环境中MDRB负荷较低，但可演变为抗性基因储库。穿山甲因传统食用与药材需求遭东南亚大规模非法跨境贩运，东南亚公共卫生体系薄弱、抗生素滥用致环境残留，使野生穿山甲可能富集MDRB。此前野生鸟类与圈养野生动物AMR研究较多，但穿山甲等野生哺乳动物携带MDR机制不清，故研究人员于中国深圳2018年12月查获的22只活体马来穿山甲粪便中分离鉴定细菌，旨在表征其源MDR大肠杆菌的AMR谱、基因组特征、质粒结构及传播潜力。该研究发表于《Integrative Zoology》。

关键技术方法上，研究人员从深圳野生动物救护中心没收的22只活体马来穿山甲采集新鲜粪便样本，经MacConkey琼脂与MH平板初筛、16S rDNA鉴定获得大肠杆菌分离株；以肉汤微量稀释法（CLSI/EUCAST标准）行药敏试验，筛选5株MDR大肠杆菌（M172-1、S171-1、M171-1、S163-2、M159-1）；采用Nanopore三代测序平台行全基因组测序，借助CARD、PlasmidFinder、INTEGRALL、ISfinder等数据库做基因组注释与质粒不相容群预测；以大肠杆菌J53为受体行质粒接合转移实验，以Galleria mellonella幼虫感染模型评致病力，并选33株中外大肠杆菌构建全基因组系统发育树。

研究结果部分，3.1抗生素耐药表型显示5株分属ST354、ST206、ST48，对β-内酰胺类、氯霉素、氟喹诺酮类、磺胺类高度耐药，对亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）、阿米卡星敏感，无溶血性。3.2五株共18个质粒中16个为携ARG耐药质粒，IncX1/IncX1型（如pM172-1.3）及IncN/IncX1、IncFIB、IncP1等多次出现，ARG涵盖bla_CTX-M系列、bla_TEM-1、bla_OXA-10、aac(3)-IId、cmlA5、sul2、qepA2、tet(A)等，上下游伴IS26、Tn1721等转座子/插入序列构成水平基因转移（HGT）片段。3.3耐药质粒为HGT片段演化播散主载体，pM172-1.3为两拷贝IncX1融合对称结构，携MDR_1与MDR_2两段相同HGT片段（含IS50R—aph(3′)-IIa—IS15DI、IS15DI—tet(A)—TnAs1及IntI1-class 1 integron—arr-2—cmlA5—bla_OXA-10—ant(3″)-IIa—dfrA14），同源质粒见于中瑞等多国肺炎克雷伯菌与大肠杆菌。3.4 PathogenFinder预测五株致病概率≥0.9，但fimH与血清型（O153:H34等）关联弱，幼虫感染72小时存活率与ATCC25922无显著差异（p>0.05），证实为非/低致病株；系统发育树示ST48三株聚东亚东南亚支，ST206与越南株同支，ST354演化节点较早。3.5幼虫感染实验验证五株致病力近似参考株。3.6接合实验证所有供体菌可将IncFIB/IncN/IncX1/IncHI2/IncP1质粒转入J53，接合频率10^?7~10^?2，转接合子获AMP、CRO、氯霉素、SXT等耐药表型且与供体ARG对应。

讨论与结论部分，研究人员指出马来穿山甲东南亚原生、非法跨境贩运增加病原体与AMR决定因子跨区传播机会；五株虽非高致病但携临床一线多类ARG，契合东南亚环境抗生素污染选择压。β-内酰胺酶以bla_TEM-1联合bla_CTX-M-65/bla_CTX-M-130/bla_CTX-M-55及bla_OXA-10共存，氨基糖苷修饰酶缺aac(6′)-I故阿米卡星敏感。IncX1型质粒及其class 1 integron—IS26—Tn1721模块、IncP1高价接合频率（最高4×10^?2）构成ARGs跨种高速扩散基础。结论为：伴随马来穿山甲非法跨境贩运，携多ARG的MDR大肠杆菌广泛传播，东南亚水土抗生素污染致野生宿主定植MDRB，贩运链中粪便与环境废物排放促耐药株与环境敏感株间基因交换，该研究为强化非法野生动物贸易监测、跨境阻截与救援动物AMR例行 Surveillance 提供科学依据，凸显野生动物非可控贸易的公共卫生安全风险。