: SbWRKY62与SbERF096协同激活紫檀芪生物合成并靶向木聚糖酶抑制蛋白以赋予高粱炭疽病抗性

《Plant, Cell & Environment》：SbWRKY62 Coordinates With SbERF096 to Activate Pterostilbene Biosynthesis and Targets a Xylanase Inhibitor Protein for Anthracnose Resistance in Sorghum

　　

由Colletotrichum sublineola (C. sublineola)引起的高粱炭疽病是一种导致严重作物减产的毁灭性病害。紫檀芪是一种植保素，有助于高粱的防御反应，但其生物合成的转录调控机制尚不清楚。在此，研究人员鉴定了两个转录因子SbERF096和SbWRKY62，它们在C. sublineola感染后被诱导，且在抗病品种SC748-5中的表达水平显著高于感病品种BTx623。SbERF096通过结合GCC box直接激活编码二苯乙烯合酶的SbSTS1，而SbWRKY62通过结合W-box motifs直接激活编码二苯乙烯O-甲基转移酶(SOMT)的SbSOMT，这是首个被发现的调控SOMT基因的转录因子。在本来不产生二苯乙烯的本氏烟草中瞬时共表达SbERF096和SbWRKY62，分别从其天然启动子促进了SbSTS1和SbSOMT的表达，导致紫檀芪积累增加。此外，SbWRKY62直接靶向SbXIP1，该基因被预测编码木聚糖酶抑制蛋白，这是一种与细胞壁防御相关、可能增强物理屏障的蛋白质。这些发现表明，SbWRKY62可以通过双重防御途径赋予炭疽病抗性，即与SbERF096协同诱导植保素并激活XIP的产生。该研究工作为培育增强炭疽病抗性的高粱提供了新的分子靶点。

植物在抵御病原菌侵染时会合成植保素（phytoalexin，植物产生的一类低分子量抗菌化合物）等次生代谢物以限制病原菌生长。二苯乙烯类物质是一类多酚类植保素，不仅参与植物防御，还对人体健康有益。在植物体内，苯丙烷途径（PPP）提供通用底物p-香豆酰CoA，由查尔酮合酶催化生成类黄酮。而在积累二苯乙烯的植物中，二苯乙烯合酶（STS，催化底物生成白藜芦醇的关键酶）利用相同底物启动二苯乙烯合成。高粱是全球第五大谷类作物，作为C₄植物广泛种植。高粱不仅能产生生氰糖苷等化学防御物质，还能产生3-脱氧花青素和新型植保素紫檀芪来抵抗高粱炭疽病。紫檀芪是白藜芦醇的衍生物，由SbSTS1催化生成白藜芦醇，再由二苯乙烯O-甲基转移酶（SbSOMT，催化连续O-甲基化反应的酶）将其依次转化为松柏芪和紫檀芪。尽管前期研究已鉴定出这两种关键酶，但单子叶植物中STS和SOMT基因的转录调控机制仍不清楚。虽然葡萄等双子叶植物中已报道MYB和WRKY等转录因子能调控STS基因，但关于SOMT基因的转录调控尚未见报道。因此，探究高粱中紫檀芪生物合成的转录调控网络对理解植物免疫及抗病育种具有重要意义。针对这一问题，研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Plant, Cell 》期刊上。该研究鉴定了两个受病原菌诱导的转录因子，并揭示了它们在调控紫檀芪合成及细胞壁防御中的双重作用，为高粱抗炭疽病分子育种提供了重要靶点。

研究人员在开展本研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先利用生物信息学分析启动子顺式元件并结合转录组数据筛选差异表达基因。随后采用双荧光素酶报告基因（DLR，用于检测转录因子对启动子激活作用的实验）进行转录激活分析；在高粱原生质体中进行过表达及qRT-PCR分析。在植物体内功能验证方面，采用农杆菌介导的本氏烟草瞬时表达系统，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测代谢物。此外，利用酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率实验（EMSA）和染色质免疫共沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）验证DNA与蛋白质的互作。最后，通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq）挖掘新的下游靶基因。研究使用了感病品种BTx623和抗病品种SC748-5的样本队列，并结合已发表的受感染中胚轴转录组数据集（如PRJNA525011）进行综合分析。

2.1 Transactivation of Pathogen-Induced TFs on the Promoters of SbSTS1 and SbSOMT
研究人员通过生物信息学分析SbSTS1和SbSOMT启动子上的结合位点，结合转录组数据筛选出35个差异表达基因。通过DLR实验发现，SbJAMYB、SbM000480和SbMYB2-like能激活SbSOMT启动子；SbWRKY6和SbWRKY62分别激活SbSTS1和SbSOMT启动子；SbERF096也能激活SbSTS1启动子。

2.2 Overexpression of Pathogen-Induced TFs in Sorghum Protoplasts
在高粱原生质体中进行过表达实验，qRT-PCR分析结果表明，过表达SbERF096显著上调了SbSTS1的表达，而过表达SbWRKY62则特异性上调了SbSOMT的表达，说明两者分别参与调控这两个靶基因。

2.3 Activation of Pterostilbene Accumulation by SbERF096 and SbWRKY62 in planta
在本氏烟草中进行瞬时共表达及代谢物检测，结果表明，SbERF096能促进SbSTS1介导的白藜芦醇积累（以虎杖苷形式检测）；SbWRKY62能促进SbSOMT介导的紫檀芪积累。两者共表达在植物体内成功促进了紫檀芪的合成。

2.4 Expression Analysis of SbERF096 and SbWRKY62 in Infected Sorghum
对感病品种BTx623和抗病品种SC748-5接种Colletotrichum sublineola后的表达分析表明，两基因均在感染后被诱导上调，且在抗病品种SC748-5中的表达量显著高于感病品种。

2.5 Phylogenetic Analysis of SbERF096 and SbWRKY62
系统发育分析表明，SbERF096和SbWRKY62分别与禾本科须芒草族等近缘物种的同源蛋白聚为一类，说明它们在禾本科进化中高度保守。

2.6 Interaction of SbERF096 and SbSTS1 Promoter
通过Y1H、ChIP-qPCR和EMSA实验证实，SbERF096在体内和体外均能直接结合到SbSTS1启动子S3片段中的GCC box基序上，从而激活该基因表达。

2.7 Interaction of SbWRKY62 and SbSOMT Promoter
通过启动子缺失实验、DLR、EMSA和ChIP-qPCR证实，SbWRKY62能够直接结合于SbSOMT启动子500bp片段内的W-box motif 1和motif 2，通过特异性结合这些基序来调控基因表达。

2.8 Identification of Additional Target Genes of SbWRKY62 by DAP-seq
为寻找SbWRKY62的其他靶基因，研究人员进行了DAP-seq，结合转录组数据鉴定出9个候选基因。通过DLR和qRT-PCR验证发现SbWRKY62能特异激活SbXIP1。进一步的EMSA和ChIP-qPCR证实SbWRKY62直接结合于SbXIP1启动子的motif 2。表达分析显示，感染后SbXIP1在抗病品种SC748-5中的表达量显著高于感病品种。

在讨论部分，研究人员指出，SbERF096属于AP₂/ERF转录因子家族，在进化上独立于葡萄中已报道的ERF转录因子，代表了禾本科中特异招募用于调控STS基因表达的转录因子。SbWRKY62属于第III组WRKY家族，由于在其他禾本科植物中缺少SbSOMT直系同源基因，SbWRKY62极可能是在须芒草族分化后获得了对SbSOMT基因的独特调控作用。此外，研究揭示了SbWRKY62具备双重防御调控机制：一方面与SbERF096协同激活紫檀芪合成以抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长；另一方面通过直接结合W-box激活SbXIP1表达。SbXIP1编码木聚糖酶抑制蛋白（XIP，抑制真菌木聚糖酶活性的防御蛋白），能够抑制病原菌分泌的木聚糖酶活性，从而延缓植物细胞壁降解并限制病原菌定殖。综上所述，该研究阐明了SbERF096和SbWRKY62是高粱病原菌诱导的二苯乙烯生物合成的直接上游调控因子。特别是首次为解析植物中SOMT基因的分子调控机制提供了线索，并揭示了SbWRKY62在激活植保素和细胞壁防御蛋白方面的双重调控功能。这些研究成果不仅加深了对紫檀芪生物合成转录调控网络的理解，也为未来高粱抗炭疽病分子育种提供了宝贵的候选靶点。