《Poultry Science》：Full thickness three-dimensional mapping of neuronal populations within the avian enteric nervous system
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肠神经系统（enteric nervous system, ENS）是家禽胃肠道肠肌活动的主要调节者，调控分泌过程和消化功能，同时在肌层水平参与针对病原体感染的免疫保护。尽管ENS的结构和功能在哺乳动物中已得到充分研究，但对家禽ENS的认识仍然有限。在本研究中
肠神经系统（enteric nervous system, ENS）是家禽胃肠道肠肌活动的主要调节者，调控分泌过程和消化功能，同时在肌层水平参与针对病原体感染的免疫保护。尽管ENS的结构和功能在哺乳动物中已得到充分研究，但对家禽ENS的认识仍然有限。在本研究中，研究人员利用组织透明化技术和免切片三维成像，首次对鸡ENS三维环境中的神经元群体和结构组织进行了全面表征。取29日龄鸡的回肠、盲肠和结肠全层组织，经4%多聚甲醛固定，并对泛神经元胞体标志物HuC/D及神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）（氮能抑制性神经元及连接纤维的标志物）进行染色。组织透明化处理结合共聚焦显微镜，可在各肠段的肌间神经丛和黏膜下神经丛中实现对肠神经元胞体和纤维的最佳可视化。鸡ENS表现出明显的区域特化：回肠和结肠的神经节密度高于盲肠（p < 0.05）；黏膜下神经丛的神经元密度更高、所含神经节也多于肌间神经丛（p < 0.05），凸显了其在调节由持续进食所驱动的强烈消化活动中的核心作用。值得注意的是，盲肠中氮能神经元的比例更高（p < 0.05），提示其对缓慢节段性运动具有更强的抑制性控制，以支持微生物介导的发酵和液体潴留。研究结果建立了一种全新的染色和透明化方法，可保留鸡肠壁中ENS单元的空间组织。该方法为家禽研究者探究ENS在家禽肠道健康中的功能贡献提供了有价值的平台。
家禽胃肠道在连续摄食过程中不断承受机械和化学刺激，各肠段逐渐形成特化的结构与功能，以支持饲料加工、营养吸收和防御有害物质。肠道肌肉活动的主要调节者是肠神经系统（enteric nervous system, ENS），该网络由嵌入肠壁的神经元和胶质细胞组成，协调肠道大部分功能。在哺乳动物中，ENS的结构和功能研究已较为深入，但家禽ENS的解剖组织信息仍然有限。传统研究多依赖二维组织学切片和单层全mount制备，难以完整呈现肠道神经丛的三维（three-dimensional, 3D）连续结构。近年来组织透明化技术通过去除脂质和匹配折射率使组织光学透明，可与共聚焦显微镜结合实现免切片三维成像。因此，研究人员旨在开发并应用一种组织透明化与全层染色方法，对鸡胃肠道ENS进行三维可视化，从而表征其神经节的分布和结构。该研究发表在《Poultry Science》。
本研究使用29日龄雄性肉种鸡（Cobb，Siloam Springs, AR）5只，饲养在美国农业部家禽设施内，取样部位为回肠远端、盲肠和结肠。全层组织经4%多聚甲醛固定后，以HuC/D（泛神经元胞体标志物）和神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）进行免疫荧光染色，采用Ce3D透明化处理，使用共聚焦显微镜（Leica Stellaris 5）获取10×和20×物镜的全层Z-stack，并通过FIJI软件分析神经节面积、数量和神经元密度。抗体特异性通过Jess毛细管电泳验证。
**1. 肌间神经丛的分布与密度**
通过10倍物镜多拼图成像和HuC/D/nNOS染色，研究人员发现回肠和结肠比盲肠拥有更多小和中等大小的肌间神经节；回肠的HuC/D阳性肌间神经节面积占比显著高于盲肠和结肠，而nNOS阳性肌间神经丛面积在结肠最大。这些结果表明肌间从神经支配密度存在区域差异。
**2. 黏膜下神经丛的分布与密度**
类似方法显示，回肠的黏膜下小和中等神经节数量显著高于盲肠和结肠，且回肠和结肠的黏膜下神经节面积占比高于盲肠。结肠nNOS阳性黏膜下神经丛面积远大于盲肠。由于回肠黏膜下神经纤维较细，未分析其神经丛面积。
**3. 肌间丛与黏膜下丛神经节密度比较**
两两比较发现，黏膜下丛小神经节密度在回肠、盲肠和结肠分别约为肌间丛的18倍、11倍和2倍，中等和大神经节在不同肠段也有类似趋势。HuC/D阳性黏膜下神经节面积占比在三个肠段都显著高于肌间丛，但nNOS阳性纤维面积在两个神经丛间无显著差异。
**4. 肌间神经节神经元定量**
20倍物镜定量显示，小神经节中HuC/D阳性神经元密度显著高于中等和大神经节。回肠的中等和大神经节中的神经元密度高于盲肠和结肠。盲肠小神经节中nNOS阳性神经元密度显著高于回肠和结肠，且盲肠的nNOS阳性神经元比例最高。
**5. 黏膜下神经节神经元定量**
黏膜下从的小神经节中，回肠的HuC/D阳性神经元密度高于盲肠和结肠。盲肠在所有大小的黏膜下神经节中均表现出最高密度和最高比例的nNOS阳性神经元。结肠的氮能神经元比例随神经节增大而增加。
**6. 肌间与黏膜下神经节神经元密度比较**
总体来看，黏膜下神经丛的中等和大神经节中HuC/D阳性神经元密度在盲肠和结肠显著高于肌间丛。然而，肌间丛中氮能神经元的比例普遍高于黏膜下丛。按组织面积计算，回肠黏膜下丛的神经元总数高于肌间丛，而盲肠黏膜下丛的氮能神经元密度高于肌间丛。
**7. 抗体验证**
采用Jess毛细管电泳，在鸡脑和肠道样品中检测到HuC/D预期峰（约38和44 kDa）和nNOS峰（约150 kDa），阴性对照无峰，验证了抗体的特异性。
讨论与结论：该研究利用组织透明化技术成功保留了鸡ENS的三维结构，避免了切片造成的结构扭曲。研究证实鸡ENS存在明显的区域和神经丛特异性：回肠和结肠拥有更密集的神经节网络，以支持快速消化和推进；盲肠则富集氮能神经元，与其缓慢发酵和液体保留功能相适应。与哺乳动物不同，鸡黏膜下从的神经元密度高于肌间丛，这可能反映了连续进食下对分泌、吸收和局部肌肉活动调节的高需求。总之，这项研究为家禽ENS研究提供了一种可及的技术平台，并奠定了鸡肠道神经解剖的基线数据，有助于未来探索营养、疾病和应激因素对家禽肠道健康的影响。结论是，鸡下消化道ENS呈显著的神经丛和区域异质性，黏膜下丛高神经元密度和盲肠高比例氮能神经元可能是优化消化效率、维持微生态和促进家禽生产性能的结构基础。
