糖酵解烯醇化酶1诱导的H4K12乳酸化激活三阴性乳腺癌中的静止型乳腺癌干细胞样细胞

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Glycolytic enolase 1-induced H4K12 lactylation activates quiescent breast cancer stem-like cells in triple-negative breast cancer

　　

**摘要**
静止型或极慢周期乳腺癌干细胞样细胞（quiescent breast cancer stem-like cells, qsBCSCs）的激活促进肿瘤进展，但其在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）中的调控机制仍不清楚。研究人员开发了一种结合NANOG-EGFP和H2B-mCherry脉冲-追踪标记的双报告系统，用于在体外和体内分别识别qsBCSCs和活跃型乳腺癌干细胞样细胞（active BCSCs, aBCSCs）。aBCSCs表现出显著的糖酵解和乳酸化特征富集，这一发现在TNBC患者样本的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）中得到验证。糖酵解酶烯醇化酶1（Enolase 1, ENO1）的表达与aBCSCs中组蛋白H4赖氨酸12乳酸化（histone H4 lysine 12 lactylation, H4K12la）水平升高呈正相关。功能研究揭示了一个正反馈回路：ENO1升高的乳酸促进H4K12la，进而激活ENO1的转录。ENO1-乳酸-H4K12la轴通过增强增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的转录来激活qsBCSCs。抑制ENO1或H4K12la可阻止PCNA上调和qsBCSC激活。重要的是，仅敲低PCNA即可阻断外源性L-乳酸钠（sodium L-lactate, NALA）诱导的qsBCSC激活。在乳腺癌原位小鼠模型中，ENO1的基因敲除和乳酸产生的药理学抑制均通过阻断qsBCSC激活来减弱肿瘤生长。临床上，ENO1表达与PCNA表达密切相关，两者高表达均预示较差的总生存期（overall survival, OS）、无复发生存期（relapse-free survival, RFS）和无远处转移生存期（distant metastasis-free survival, DMFS）。研究结果确立了ENO1-H4K12la-PCNA轴作为qsBCSC激活的关键代谢-表观遗传驱动因子，并可作为TNBC的治疗靶点。

**论文解读：ENO1-H4K12la-PCNA轴驱动三阴性乳腺癌静止型干细胞样细胞激活的代谢-表观遗传机制**

**一、研究背景与科学问题**

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，以高复发率、高转移率和治疗耐药为特征，这些恶性表型与乳腺癌干细胞样细胞（breast cancer stem-like cells, BCSCs）密切相关。肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）可在静止态与激活态之间动态转换，静止态CSCs的“苏醒”被认为是肿瘤侵袭性进展的重要驱动因素。然而，在TNBC中调控静止型或极慢周期乳腺癌干细胞样细胞（quiescent BCSCs, qsBCSCs）激活的分子机制尚不明确。已有研究表明，静止态与激活态CSCs表现出不同的代谢依赖性，例如在急性髓系白血病中，静止态CSCs依赖氧化磷酸化，而激活态CSCs优先利用糖酵解；在多种实体瘤中，静止态或慢周期CSCs的糖酵解活性、葡萄糖消耗和乳酸产生均低于激活态CSCs。糖酵解关键酶烯醇化酶1（Enolase 1, ENO1）催化磷酸烯醇式丙酮酸的产生，在多种癌症中过表达并发挥促癌作用。然而，ENO1是否参与qsBCSCs的激活尚未阐明。此外，乳酸衍生的组蛋白乳酸化修饰（如H4K12la）已被证实可调控基因转录，但ENO1来源的乳酸是否通过组蛋白乳酸化影响qsBCSC激活仍是空白。因此，本研究旨在阐明TNBC中qsBCSC激活的代谢-表观遗传调控机制。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员开发了整合NANOG启动子驱动的EGFP报告基因（用于富集干细胞样细胞）和H2B-mCherry脉冲-追踪标记（用于区分静止态与激活态）的双报告系统“StemQ”，从而在体外和体内分别鉴定和分离aBCSCs（EGFP⁺mCherry^?）与qsBCSCs（EGFP⁺mCherry⁺）。利用该系统，研究人员发现aBCSCs显著富集糖酵解和乳酸化特征，这一发现在TNBC患者样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）中得到验证。机制研究表明，ENO1通过产生乳酸促进组蛋白H4K12乳酸化（H4K12la），而H4K12la又反馈性激活ENO1转录，形成ENO1-乳酸-H4K12la正反馈回路。该回路进一步促进增殖细胞核抗原（PCNA）的转录，从而驱动qsBCSCs的激活。在乳腺癌原位小鼠模型中，遗传敲除ENO1或药理学抑制乳酸产生均可通过阻断qsBCSC激活来抑制肿瘤生长。临床数据分析显示，ENO1表达与PCNA表达显著正相关，两者高表达均预示不良的生存预后。该研究确立了ENO1-H4K12la-PCNA轴作为qsBCSC激活的关键驱动因子，为TNBC治疗提供了潜在靶点。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

**三、主要关键技术方法**

本研究采用了以下关键技术方法：（1）构建双报告系统StemQ，结合NANOG-EGFP干细胞报告与H2B-mCherry脉冲-追踪标记，用于区分和分离aBCSCs与qsBCSCs；（2）利用RNA测序（RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）及基因集富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）进行转录组学分析；（3）采用染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）和切割下靶及标记（CUT&Tag）技术检测组蛋白H4K12la在靶基因启动子区的富集；（4）通过 Seahorse 细胞外酸化率（ECAR）测定评估糖酵解活性，并检测细胞内乳酸水平；（5）利用蛋白质印迹、免疫荧光和3D培养等技术验证蛋白表达和细胞功能；（6）应用基因敲低（shRNA/siRNA）、基因敲除（CRISPR-Cas9）及药理学抑制剂（如ENO1抑制剂AP-III-a4、p300抑制剂C646、糖酵解抑制剂2-DG）进行功能干预；（7）构建乳腺癌原位小鼠模型，包括免疫健全BALB/c小鼠（4T1细胞）和免疫缺陷裸鼠（MDA-MB-231细胞），并结合临床数据库（如TCGA、GEPIA2、Kaplan-Meier plotter和转移性乳腺癌项目队列）进行临床相关性分析。

**四、研究结果**

**1. 活跃型BCSCs表现出升高的ENO1来源乳酸水平和H4K12乳酸化**
研究人员通过StemQ系统从MDA-MB-231、HCC-1806和4T1细胞中分离aBCSCs和qsBCSCs。RNA-seq和GSEA分析显示，aBCSCs显著富集糖酵解和乳酸化特征。在糖酵解酶中，ENO1 mRNA和蛋白水平在aBCSCs中显著升高。同时，aBCSCs表现出更高的细胞外酸化率（ECAR）、细胞内乳酸水平以及组蛋白H4K12la修饰水平，而其他位点的乳酸化（如H4K5la、H4K8la、H3K9la、H3K18la、H3K23la）无显著差异。原位小鼠肿瘤模型进一步验证了aBCSCs中ENO1和H4K12la的高表达。TNBC患者样本的scRNA-seq分析也证实了aBCSCs具有更高的糖酵解和乳酸化评分及ENO1表达。

**2. ENO1-乳酸-H4K12la回路调控BCSC激活**
通过ENO1敲低和敲除实验，研究人员发现ENO1缺失显著降低细胞内乳酸水平、Pan-Kla和H4K12la修饰，并抑制BCSC增殖、促进qsBCSC富集。ENO1敲低减少了H4K12la在其自身启动子上的富集。使用糖酵解抑制剂2-DG处理可降低细胞内乳酸、H4K12la水平和ENO1表达，而补充外源乳酸钠（NALA）可逆转这些效应。进一步研究发现p300（由EP300编码）是催化H4K12la的主要乳酸转移酶，敲低EP300或使用其抑制剂C646可降低H4K12la水平、ENO1表达及H4K12la在ENO1启动子上的富集。这些结果表明ENO1、乳酸和H4K12la形成正反馈回路，共同驱动qsBCSC激活。

**3. ENO1-乳酸-H4K12la轴激活PCNA转录**
通过整合ENO1敲低组、qsBCSCs vs aBCSCs转录组及H4K12la CUT&Tag数据，研究人员鉴定出PCNA为关键靶基因。aBCSCs中PCNA启动子区域富集H4K12la，而ENO1敲低或2-DG处理可减少H4K12la在PCNA启动子上的富集并下调PCNA表达，NALA补充可逆转这些效应。EP300敲低或C646处理同样降低PCNA mRNA和蛋白水平及H4K12la在PCNA启动子上的富集。这些结果表明ENO1-乳酸-H4K12la轴通过表观遗传机制转录激活PCNA。

**4. H4K12la促进的PCNA转录依赖ENO1催化活性**
研究人员构建了ENO1野生型（WT）和催化失活突变体（S40A/D245R, Mut）。在ENO1敲低细胞中，WT ENO1可恢复酶活性、细胞内乳酸水平、H4K12la修饰和PCNA表达，而Mut无此效果。在qsBCSCs中过表达WT ENO1可促使其向aBCSCs转化并增强增殖能力，而Mut则无此作用。此外，ENO1抑制剂AP-III-a4处理可降低aBCSCs中H4K12la在PCNA启动子上的富集，但对qsBCSCs无影响。这证实了ENO1催化活性对于H4K12la介导的PCNA转录激活至关重要。

**5. H4K12la增强的PCNA表达促进qsBCSC激活**
在2-DG富集qsBCSCs的模型中，NALA补充可上调PCNA表达并促进qsBCSC激活，而PCNA敲低可阻断这些效应。在ENO1抑制剂处理的模型中，NALA诱导的PCNA上调和qsBCSC激活同样被PCNA敲低所抑制。这些结果证明H4K12la驱动的PCNA上调是qsBCSC激活的必要条件。

**6. ENO1敲低或药理学抑制乳酸产生可抑制qsBCSC激活**
临床数据库分析显示ENO1与PCNA mRNA水平显著正相关，两者高表达均与不良的OS、RFS和DMFS相关。在原位乳腺癌小鼠模型中，ENO1敲低显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤组织中ENO1、PCNA和H4K12la水平，并增加EGFP⁺mCherry⁺ qsBCSC群体的比例。2-DG处理同样抑制肿瘤生长并降低乳酸水平，而补充NALA可逆转这一抑制效应并促进qsBCSC激活。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，本研究通过StemQ系统揭示了aBCSCs中糖酵解和乳酸化特征的富集，并证实ENO1-乳酸-H4K12la正反馈回路是驱动qsBCSC激活的关键机制。PCNA作为H4K12la的直接靶基因，其转录激活依赖于ENO1的催化活性。这一发现阐明了代谢-表观遗传调控网络在肿瘤干细胞命运决定中的重要作用。与经典的Rb-E2F回路类似，ENO1-乳酸-H4K12la回路可能通过持续提供乳酸、将增殖相关基因表达提升超过临界阈值来触发qsBCSC激活。在临床方面，ENO1和PCNA的高表达与不良预后显著相关，提示靶向这一代谢-表观遗传网络可能成为TNBC治疗的新策略。研究结论部分强调：ENO1-H4K12la-PCNA轴是控制CSCs静止-激活转换的关键调控通路，药理学抑制乳酸产生（如2-DG）可有效阻断qsBCSC激活并抑制肿瘤生长，为TNBC治疗提供了有前景的干预靶点。然而，该轴与临床肿瘤休眠之间的因果关联仍需进一步研究。