与阿拉巴马州水产养殖场中黑足库蚊（Culex nigripalpus）相关的病毒序列的转录组学分析

《Virology》：Metatranscriptomic analysis of viral sequences associated with Culex nigripalpus at an Alabama aquaculture site

　　

摘要

与水产养殖栖息地相关的蚊子可能携带多种病毒，但许多当地常见物种的病毒组仍知之甚少。在阿拉巴马州奥本市的一个与水产养殖相关的地点，我们对蚊子种群进行了调查，发现Culex nigripalpus是主要采集到的蚊子物种。为了研究这种蚊子所携带的病毒，我们对雌性Cx. nigripalpus的RNA进行了序列分析（RNA-seq），并比较了不同的生物信息学方法在病毒检测和基因组恢复方面的效果。一种方法是通过将读段映射到最接近的蚊子参考基因组来进行去除宿主相关读段的操作，而另一种方法则完全采用de novo组装并进行病毒数据库注释。此外，我们还进行了蛋白质水平的过滤、不同方法之间的比较以及Trinity和rnaSPAdes组装结果的对比，以确定病毒候选物的可靠性。在初步分析中，共发现了16个病毒序列，这些病毒属于12个不同的病毒/名称组，包括Merida病毒、湖北蚊病毒5型、浙江蚊病毒、湖北virga样病毒3型、Rinkaby病毒、Elemess病毒、青帘蚊病毒、塞尔维亚narna样病毒2型、向云narna-levi样病毒8型、Ecclesville picorna样病毒以及类似杆状病毒的片段。一些病毒候选物在多个分析中都得到了支持，而另一些则只在特定的分析条件下被检测到，这表明病毒候选物的检测结果受到组装和过滤方法的影响。最终选定的病毒序列通过RT-PCR扩增得到了独立验证。总体而言，这些结果提供了首次关于阿拉巴马州水产养殖环境中Cx. nigripalpus携带的病毒序列的描述，并表明通过比较不同的组装和过滤策略有助于确定最可靠的病毒候选物。

引言

蚊子（双翅目：Culicidae）是一种分布广泛的昆虫群体，包含超过3600种蚊子，其中许多是寄生虫、病毒和细菌的传播媒介（Nebbak等人，2021年）。蚊子的幼虫和蛹阶段需要水环境；因此，农田、废水、污水、鸟浴池以及任何积水的地方都成为它们栖息的理想场所（Morse等人，2019年）。在农业环境中，这主要包括稻田和渔业生态系统。属于Culex和Aedes属的蚊子是多种病毒（如Flaviviridae、Rhabdoviridae、Togaviridae以及Bunyavirales目病毒）的传播媒介（Gómez等人，2023年）。

蚊子与多种病毒有关，其中包括具有医学意义的虫媒病毒以及许多尚未被充分研究的昆虫相关病毒。在美国东南部，Culex属蚊子与东部马脑炎病毒和西尼罗河病毒等疾病的传播密切相关，而Cx. nigripalpus也被认为可能是这些病毒在区域传播中的传播媒介（Bingham等人，2016年；Godsey等人，2013年；Hughes等人，2021年；Richards等人，2011年）。同时，蚊子所携带的病毒多样性远超已知的人类和兽医病原体。这种广泛的病毒组可能受到蚊子种类、栖息地以及宿主相互作用的影响，因此阿拉巴马州的水产养殖环境成为研究当地常见蚊子相关病毒序列的理想场所。

渔业是阿拉巴马州的重要产业，2023年该州鲶鱼产量达到了4510万条，仅次于密西西比州（美国农业部-国家农业统计局数据）。养鱼池塘为鸟类提供了丰富的栖息地，包括猛禽、涉禽、水禽和鸣禽（Burr等人，2020年）。这些生态系统还栖息着多种爬行动物和两栖动物，如龟类、蛇类和青蛙（Bailey，1998年；Mount，1975年）。许多这些脊椎动物可以成为本土病毒的宿主，并成为多种蚊子的血液来源。阿拉巴马州发现有几种具有医学意义的蚊子种类，包括Aedes aegypti、Ae. albopictus、Ae. japonicus、Culex pipiens、Cx. tarsalis、Cx. quinquefasciatus和Anopheles quadrimaculatus。在附近的塔斯基吉国家森林中也发现了其他蚊子种类，如Culiseta melanura、Culex restuans、Aedes vexans、Coquillettidia perturbans、Cx. erraticus、Cx. peccator等（Hassan等人，2003年）。总的来说，阿拉巴马州记录有60多种蚊子，包括Cx. territans、Ochlerotatus triseriatus、Cx. salinarius、Anopheles punctipennis和An. quadrimaculatus（Qualls和Mullen，2006年）。Culex nigripalpus以及三种Psorophora属蚊子（Ps. columbiae、Ps. ferox和Ps. ciliata）也在邻近的梅肯县被记录到（Shaikh等人，1987年）。这表明Cx. nigripalpus在包括我们研究地点在内的阿拉巴马州东部中心地区已建立稳定的种群。鲶鱼养殖环境中物种、宿主和病毒的富集程度尚不明确，本研究旨在探讨水产养殖可能对这些蚊子种群产生的影响。

为了研究我们所在地区蚊子的新病毒和微生物组，我们将研究对象定位于一个具有三个关键因素的生态系统：靠近住宅区和人类居住区、靠近未开发的森林区域，以及靠近可能促进蚊子种群增长的水产养殖场。具体而言，我们在奥本市北部选了一个靠近Kreher森林的渔业池塘作为研究地点，该池塘距离大规模住宅区不到一英里。我们旨在探讨这种独特环境中的蚊子种群情况，并将其与阿拉巴马州的宝贵经济作物——渔业结合起来进行分析。2022年初秋期间，我们收集了蚊子样本以评估物种多样性并确定最丰富的本地传播媒介。接下来的目标是分析该优势物种所携带的病毒组，并比较不同的生物信息学方法。我们假设至少有一种蚊子会在水产养殖池塘中占主导地位，并可能携带多种本地病毒。虽然由于当地未 Reports 疫情爆发，我们并不期望检测到已知的人类病原体，但我们推测这种主要传播媒介可能携带多种尚未被描述的病毒，从而可以用来比较不同生物信息学方法的优劣。

章节片段

采集地点

用于这项研究的蚊子是在美国阿拉巴马州奥本市的E.W. Shell渔业中心捕获的（图1A）。我们在水产养殖池塘附近以及人们经常走动的建筑物附近设置了陷阱。E.W. Shell渔业中心是一个占地1600英亩的研究站，包含基础设施和自然栖息地，适合研究多种鲶鱼和鳟鱼。

方法二：de novo基因组组装

原始序列数据的处理遵循了与方法一相同的质量控制和修剪步骤，但没有进行参考基因组比对或宿主读段去除。高质量的读段使用Trinity（Galaxy版本2.11.0）（Grabherr等人，2011年）和默认参数进行了de novo组装。长度大于400 bp的 contigs 使用BLASTN（BLAST+ 2.16.0）和E值阈值1e-5与NCBI病毒基因组数据库（viral.1.1.genomic.fna）进行比对，以生成初步的病毒谱系。

阿拉巴马州水产养殖场中Culex nigripalpus主导的蚊子群体

2022年8月至10月期间，在阿拉巴马州奥本市的E.W. Shell渔业中心的多个地点共收集了11份蚊子样本。这些样本来自森林区域与渔业之间的生态过渡带以及最近被排干的池塘，以增强生物多样性监测。从这些样本中，共收集到237只雌性蚊子，通过立体显微镜和分类学工具对其进行了性别鉴定和属种分类（表1）。

讨论

本研究发现Culex nigripalpus是阿拉巴马州水产养殖场中占主导地位的蚊子物种，并对其携带的病毒组进行了分析。为了分析RNA-Seq数据集中的病毒内容，我们采用了不同的生物信息学方法，这些方法在处理宿主序列和组装/注释contigs的方式上有所不同。在基于参考基因组的分析方法（方法一）中，读段被映射到Culex quinquefasciatus的基因组上，只有未映射的读段被组装。

结论

本研究首次描述了阿拉巴马州Culex nigripalpus的病毒组，表明水产养殖环境可以支持这种蚊子及其携带的多种主要针对昆虫的病毒。通过RNA-Seq技术，我们在渔业相关的地点检测到了至少12种与Cx. nigripalpus相关的病毒，其中一些是该物种和该地区的首次报道。其中最引人注目的是我们鉴定出的一种Merida病毒（GenBank登录号PQ963471）。

CRediT作者贡献声明

Natalie Wong：撰写、审稿与编辑、方法论设计。Kyle Oswalt：撰写、审稿与编辑、方法论设计、数据整理。John F. Beckmann：撰写、审稿与编辑、资源获取、数据分析。Chaoyang Zhao：撰写、审稿与编辑、方法论设计、数据整理。Aasma Sharma：初稿撰写、方法论设计。Kathleen Martin：撰写、审稿与编辑、资源获取、方法论设计、概念构思

关于手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本研究的过程中，作者使用了Grammarly工具来纠正语法错误和提高文本可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资助

本研究由奥本大学的昆虫学与植物病理学系资助。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

Aasma Sharma|Kyle Oswalt|Natalie Wong|Chaoyang Zhao|John F. Beckmann|Kathleen Martin

奥本大学昆虫学与植物病理学系，阿拉巴马州奥本市