不同方法提取的米糠蛋白：其水解产物的结构特性及抗氧化和抗光老化活性

《Antioxidants》：Rice Bran Proteins Extracted by Different Methods: Structural Properties and Antioxidant and Anti-Photoaging Activities of Their Hydrolysates

　　

研究人员研究了四种方法提取的米糠蛋白在组成、微观结构、红外光谱特征和酶解特性上的差异，并进一步评估了所得水解物中肽的抗氧化和抗光老化活性。超声波预处理结合碱溶酸沉法提取的米糠蛋白（URP）表现出较高的纯度（59.17%）和提取率（47.61%），同时增加了表面孔隙率、增强的水合能力和改善的酶解性能。URP水解物（URPP）的蛋白质含量为81.00%，水解度为33.57%，并具有显著的抗氧化活性（ABTS: 684.21; ORAC: 2016.15 μmol TE/g样品）。鉴定出的肽主要为短肽且富含疏水性氨基酸。结构分析表明，色氨酸的吲哚N-H基团可能在这些肽的抗氧化活性中发挥重要作用。此外，这些肽通过减少氧化应激和炎症反应，下调AP-1、MMP-1和MMP-3的mRNA表达，减轻了UVB诱导的HaCaT细胞光老化。总体而言，这些发现揭示了提取方法、米糠蛋白的结构特性和酶解特性与其衍生肽的生物活性之间的关联，为米糠蛋白的高值化利用以及抗氧化和抗光老化功能成分的开发提供了基础。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
中国年产稻米约1.85亿吨，产生约1000万吨米糠，占稻米总产量的5–7%。然而，米糠加工残渣的利用效率较低，表现为利用率有限、产品多样性不足和附加值低。目前仅10–15%的米糠用于油脂提取或生产高值产品（如植酸钙、肌醇和谷维素），大部分用作动物饲料或废弃，造成资源浪费。米糠含有约12–15%的蛋白质，具有均衡的氨基酸组成和良好的营养健康特性，其蛋白质效率比（PER）为1.6–1.9，接近酪蛋白（2.5），且消化率高。然而，米糠蛋白溶解性差，限制了其在食品和功能产品开发中的应用。酶解和生物活性肽提取策略为改善米糠蛋白的功能特性和高值化利用提供了有效途径。
不同提取方法可显著影响蛋白质结构、酶解特性和抗氧化活性。碱溶酸沉法（ASAP）易导致蛋白质变性和聚集，降低溶解度；酶法提取条件温和但得率有限；结合超声、微波等辅助技术可促进蛋白质解折叠，提高提取效率和抗氧化活性。然而，提取方法如何影响蛋白质结构、酶解行为及衍生肽的抗氧化和抗光老化活性，尚缺乏系统研究。因此，本研究旨在建立提取策略、蛋白质结构、酶解特性与肽生物活性之间的关联，为米糠蛋白的高值化利用和功能肽的靶向制备提供依据。论文发表在《Antioxidants》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用四种提取方法制备米糠蛋白：ASAP法（RP）、超声预处理结合ASAP法（URP）、酶预处理结合ASAP法（ERP）以及超声-酶联合预处理结合ASAP法（UERP）。米糠原料为南京46品种，由上海盛志农产品有限公司提供。主要技术方法包括：扫描电子显微镜（SEM）分析微观结构；傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析二级结构；碱性蛋白酶（Alcalase）酶解；超滤分级（<3 kDa组分）；超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）鉴定肽序列；密度泛函理论（DFT）计算分析活性位点；UVB诱导的HaCaT细胞模型评估抗光老化活性；RT-qPCR检测AP-1、MMP-1和MMP-3 mRNA表达。

**研究结果**
**3.1 米糠及米糠蛋白样品的基本组成**
通过常规ASAP法获得的RP蛋白纯度约65.83%，但提取率仅约37.34%。超声或酶预处理显著提高提取效率，联合应用进一步将得率提升至约50.70%，但蛋白纯度下降至约37.83%。超声预处理结合ASAP法（URP）实现了纯度和得率的平衡提升（纯度约59.17%，提取率约47.61%），表明辅助提取方法能有效提高米糠蛋白回收率。

**3.2 米糠蛋白的扫描电镜分析**
RP表面相对光滑，呈松散多层片状结构。URP经超声处理后表面孔隙增大，结构紊乱，符合空化机械效应。ERP颗粒较致密且聚集，表面附着较多物质，可能与淀粉再分布有关。UERP表现出更不规则和粗糙的表面，反映了脂质和淀粉等非蛋白组分的再分布或聚集。

**3.3 FTIR光谱分析**
所有样品在约1662 cm^-1（酰胺I带）和1545 cm^-1（酰胺II带）处出现吸收峰，另有3750–3000 cm^-1宽吸收带（N-H和O-H伸缩振动）。酰胺I带去卷积分析显示，RP以β-折叠为主（~37.61%），β-转角约25.09%。URP、ERP和UERP的β-折叠含量降低至31.22–32.69%，α-螺旋（21.34–22.00%）和无规卷曲（21.55–21.96%）比例增加，表明蛋白质柔性增强。

**3.4 米糠肽的抗氧化活性及水解度**
URPP的抗氧化活性最高，ORAC值为2016.15 μmol TE/g样品，ABTS值为684.21 μmol TE/g样品。RPP的抗氧化活性略低，ERPP和UERPP活性相当。URP的松散结构有利于酶解产生更多生物活性肽，而RPP的致密结构限制了酶的可及性。

**3.5 米糠肽的序列分析**
RPP-P5和URPP-P5分别鉴定出844和1036个肽段。PeptideRanker评分>0.5的肽中，共有114个共同肽，RPP-P5和URPP-P5分别有131和173个独特肽。共同肽以二肽至六肽为主，独特肽主要为三肽至六肽。N端疏水氨基酸占优势（亮氨酸、苯丙氨酸），C端也以疏水氨基酸为主（苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸）。URPP-P5中碱性氨基酸比例从14%降至9%，五肽比例从32%降至21%，而二肽、三肽和四肽总比例从45%升至51%。URPP-P5的N端和C端疏水氨基酸比例均高于RPP-P5（70% vs 67%）。

**3.6 米糠肽的抗氧化活性及理化性质**
从RPP-P5和URPP-P5中分别筛选出10个候选肽。RPP-P5肽含3–6个氨基酸，分子量310.14–774.40 Da；URPP-P5肽含2–4个氨基酸，分子量279.12–700.30 Da。18个肽为BIOPEP数据库未报道的新序列，其中WGRF、WPF、WL和LW（来自URPP-P5）在ABTS和ORAC测定中TE值均>1.0 μmol TE/μmol，超过阳性对照Trolox，表现出强抗氧化活性。

**3.7 合成肽活性位点的量子化学计算**
DFT计算显示，四种肽（WGRF、WPF、WL、LW）的最高占据分子轨道（HOMO）主要定位于色氨酸残基的吲哚部分，推测这些区域为自由基清除时的电子供体位点。Mulliken电荷分布和键长分析表明，活性位点对应于吲哚N-H键（如31N-71H等），该N-H基团可能作为氢供体参与自由基清除。色氨酸的吲哚N-H键无论位于N端、C端还是序列内部，均被预测为潜在反应位点。

**3.8 抗氧化肽作用机制研究**
**3.8.1 抗氧化肽对HaCaT细胞中ROS、MDA、GSH、SOD、IL-6、IL-1β和TNF-α的影响**
MTT实验表明，0.01–100 μM肽浓度下细胞活力无显著影响。UVB照射后细胞活力显著下降，肽处理组（WGRF、WPF、WL、LW）活力恢复至79–87%。UVB诱导ROS水平升高至对照的1.5倍，肽处理显著降低ROS水平至模型组的81.07–94.17%。MDA含量在肽组显著降低，GSH含量和SOD活性得到恢复，其中LW组效果最显著。肽处理还显著降低促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，LW组分别降至模型组的48.35%、48.27%和63.49%。

**3.8.2 抗氧化肽对光老化HaCaT细胞中AP-1、MMP-1和MMP-3 mRNA表达的影响**
UVB照射后AP-1、MMP-1和MMP-3 mRNA表达分别上调至对照的3.33、3.26和3.92倍。肽处理显著降低这些基因表达至模型组的45.38–80.29%，其中LW组抑制效果最强，分别降至模型组的0.52、0.54和0.45倍。Pearson相关性分析显示，ROS水平与MDA、促炎因子及MMP相关mRNA表达呈显著正相关，与GSH和SOD呈显著负相关，表明抗光老化作用与减轻氧化应激、炎症反应及下调AP-1/MMP通路相关。

**3.8.3 抗氧化肽抑制UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤的机制研究**
UVB诱导ROS过量产生，导致脂质过氧化（MDA升高），抗氧化肽通过清除自由基降低ROS水平，恢复GSH和SOD活性，维持氧化还原平衡；同时抑制促炎因子分泌，进而下调AP-1、MMP-1和MMP-3表达，减轻细胞外基质降解，从而缓解光老化损伤。

**总结与讨论**
四种提取方法显著影响米糠蛋白的结构特性和水解物的抗氧化活性。其中，URP具有较高纯度、蛋白质回收率和多孔结构，水合能力和酶反应性增强。其水解物URPP表现出强抗氧化活性。筛选出的四种新肽（WGRF、WPF、WL、LW）抗氧化活性高于阳性对照，并在UVB诱导的HaCaT细胞光老化模型中表现出保护作用，伴随氧化应激和炎症反应减轻，光老化相关分子标志物（AP-1、MMP-1、MMP-3）表达下调。总体表明，提取策略影响米糠蛋白的结构和酶解特性及其衍生肽的抗氧化活性，支持米糠蛋白作为功能肽来源的潜力。研究结论：需进一步通过体内和临床研究验证这些生物活性及潜在应用。