《Foods》：Algal and Cyanobacterial Hydrolysates as Serum-Reducing Supplements Across Mammalian, Avian and Fish Cells with Identification of Bioactive Chromopeptides
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维持健康和营养食品的可持续生产是一项重大全球挑战。培养肉（cultivated meat）可以减少畜牧生产的环境影响，但其成本仍然高昂，主要是由于胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）作为一种常见细胞培养基补充剂的费用。藻类和蓝细菌（cya
维持健康和营养食品的可持续生产是一项重大全球挑战。培养肉（cultivated meat）可以减少畜牧生产的环境影响，但其成本仍然高昂，主要是由于胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）作为一种常见细胞培养基补充剂的费用。藻类和蓝细菌（cyanobacteria）蛋白，特别是藻胆蛋白（phycobiliproteins, PBPs），是潜在生物活性肽（bioactive peptides）的有前景的可持续来源，可能有助于开发血清降低或无血清培养基。本研究调查了使用红藻坛紫菜（Porphyra haitanensis）和蓝细菌钝顶节旋藻（Arthrospira platensis）的蛋白质提取物制备的水解物（hydrolysates）作为低血清环境中细胞培养功能补充剂的潜力。通过用六种蛋白水解酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和蛋白酶K）处理钝顶节旋藻和坛紫菜的蛋白质提取物，生成了12种水解物。在哺乳动物（CHO-K1）、禽类（QM7）和鱼类（MACK1）来源的三种细胞模型中研究了这些水解物的效果。评估了水解物对细胞活力（cell viability）、增殖（proliferation）和抗氧化活性（antioxidant activity）的影响。与对照组相比，在80%降低血清和胰蛋白胨磷酸肉汤（tryptose phosphate broth, TPB）条件下，钝顶节旋藻-胰凝乳蛋白酶水解物（A. platensis–chymotrypsin hydrolysate）显著提高了QM7细胞活力（p ≤ 0.0001）。此外，肽组成分析（peptide composition analysis）和氨基酸序列鉴定（identification of amino acid sequences）为与维持和促进细胞生长相关的潜在生物活性色肽（chromopeptides）提供了初步见解。源自藻类/蓝细菌的水解物在血清降低条件下正向调节细胞活力和增殖，但效果取决于藻类物种、酶处理和细胞类型。这些发现突出了它们作为替代细胞培养基可持续补充剂的潜力。
**藻类和蓝细菌水解物作为血清降低补充剂的细胞培养应用与生物活性色肽鉴定——论文解读**
**1. 研究背景与问题**
全球人口增长对粮食安全构成严峻挑战，传统畜牧业导致温室气体排放、土地和水资源过度消耗等环境压力。培养肉（cultivated meat）作为替代蛋白来源，可减少环境影响，但其生产成本高昂，主要瓶颈在于细胞培养基中使用的胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）价格昂贵且来源动物，存在伦理、批次差异及污染风险。藻类和蓝细菌（cyanobacteria）富含藻胆蛋白（phycobiliproteins, PBPs），后者是潜在生物活性肽的前体，可经酶解释放具有抗氧化、促生长等功能的肽段。然而，目前对藻类水解物（尤其是含发色基团的色肽）作为血清降低补充剂的研究有限，且缺乏跨物种细胞系的系统评估。本研究旨在利用多种蛋白酶水解两种代表性藻类/蓝细菌的PBPs，制备水解物，并系统测试其对哺乳动物、禽类和鱼类细胞在低血清环境下的活力和增殖影响，同时鉴定其中的生物活性色肽序列，为开发可持续、低成本的培养肉培养基提供候选策略。
**2. 研究概述与意义**
研究人员使用六种蛋白水解酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和蛋白酶K）分别水解钝顶节旋藻（Arthrospira platensis）和坛紫菜（Porphyra haitanensis）的PBP提取物，制备12种水解物。在哺乳动物CHO-K1、禽类QM7和鱼类MACK1三种细胞系中，通过多种活力检测（resazurin法、中性红摄取法）和7天增殖实验筛选高效水解物，并利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和串联质谱（MS/MS）鉴定色肽序列。研究发现，效果高度依赖藻种、酶和细胞类型：P. haitanensis水解物对CHO-K1细胞活力促进作用最强，而A. platensis水解物（尤其是胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解物）对QM7和MACK1细胞表现出更优的促增殖效果。共鉴定出65种不同序列的色肽，大小2–16个氨基酸，其疏水性和电荷分布与生物活性可能相关。该研究首次系统证明藻类/蓝细菌PBP水解物中的色肽可作为功能性血清降低补充剂，为培养肉培养基的绿色替代方案提供了重要基础。
**3. 主要关键技术与方法**（不超过250字）
研究人员从商业购买的红藻坛紫菜和蓝细菌钝顶节旋藻粉末中提取藻胆蛋白，用六种蛋白酶分别水解后，经Sephadex G-25尺寸排阻色谱和1 kDa切向流超滤纯化得到水解物。使用ABTS
•+自由基清除和还原力测定评估抗氧化活性。细胞实验选用CHO-K1（哺乳动物）、QM7（禽类）和MACK1（鱼类）三种细胞系，分别在低血清条件（1%或2%FBS）下，以resazurin、中性红摄取和台盼蓝排除法检测72小时活力和7天增殖。对最有潜力的水解物，用半制备型反相高效液相色谱（Zorbax Eclipse XDB C-18柱）分离色肽组分，再通过高分辨轨道阱质谱（Orbitrap Exploris 240）进行碰撞诱导解离（CID）串联质谱分析，手动从头测序鉴定色肽氨基酸序列。
**4. 研究结果**
**3.1 藻类和蓝细菌水解物的抗氧化能力**：ABTS实验显示，P. haitanensis水解物总体抗氧化活性显著高于A. platensis水解物，其中蛋白酶K水解物活性最高（14.4 Trolox当量）；而还原力测试中，两者无显著差异，A. platensis枯草杆菌蛋白酶水解物还原力最高（3.8 Trolox当量）。表明不同藻种和酶处理会影响抗氧化谱。
**3.2 低血清条件下CHO-K1、QM7和MACK1细胞活力**：通过resazurin法检测，12种水解物在1–20 μM浓度下对细胞活力影响不同。CHO-K1细胞中，P. haitanensis水解物（尤其胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解物）效果优于A. platensis；QM7细胞中，四种酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K）水解物在两种藻间效果相近，进一步在2%FBS+2%TPB条件下重新评估发现，AP-胰凝乳蛋白酶显著提高QM7活力（最高61%）；MACK1细胞中，AP-胃蛋白酶效果最佳，而PH-蛋白酶K和PH-嗜热菌蛋白酶也表现较好。最终筛选出PH-胃蛋白酶、PH-胰凝乳蛋白酶、AP-胰凝乳蛋白酶、PH-蛋白酶K和AP-胃蛋白酶作为候选。
**3.3 中性红摄取试验验证细胞活力**：与resazurin结果趋势一致，PH-胃蛋白酶和PH-胰凝乳蛋白酶在CHO-K1中无显著差异；AP-胰凝乳蛋白酶在QM7中显著优于PH-蛋白酶K；AP-胃蛋白酶在MACK1中显著提高活力（10 μM时约32%）。但PH-蛋白酶K在QM7和MACK1中高浓度时活力下降，与resazurin结果部分矛盾，提示两种检测方法（代谢活性 vs. 溶酶体完整性）的差异。
**3.4 藻类和蓝细菌水解物对细胞增殖的影响**：7天增殖实验（台盼蓝排除法）显示，CHO-K1中PH-胃蛋白酶在10 μM时促增殖最强（群体倍增6.10次），但与PH-胰凝乳蛋白酶及对照组无显著差异；QM7中AP-胰凝乳蛋白酶呈剂量依赖性促进增殖，而PH-蛋白酶K显著抑制增殖（高浓度时约降低两倍）；MACK1中AP-胃蛋白酶在5 μM时显著促进增殖，而PH-蛋白酶K同样抑制生长。形态学观察未发现异常，pH无显著变化。
**3.5 色肽的纯化与鉴定**：对五种候选水解物（AP-胃蛋白酶、AP-胰凝乳蛋白酶、PH-胃蛋白酶、PH-胰凝乳蛋白酶、PH-蛋白酶K）进行RP-HPLC分离和MS/MS测序，共鉴定出65种色肽，长度2–16个氨基酸。AP-胃蛋白酶和AP-胰凝乳蛋白酶水解物含较大肽段，PH-胃蛋白酶含疏水性（GRAVY正值）肽段最多，PH-蛋白酶K含较多负电荷肽段。这些色肽均含有藻胆素发色基团（PEB或PCB），部分肽段富含赖氨酸和精氨酸，可能通过阳离子-膜相互作用或金属螯合促进细胞生长。
**5. 讨论与结论总结**
讨论部分指出，钙/蓝细菌水解物对细胞的影响依赖于细胞类型和抗氧化活性，但促增殖机制可能更为复杂，涉及色肽的疏水性、电荷及大小。CHO-K1细胞中，P. haitanensis水解物的抗氧化活性可能与其促生长作用相关；而在QM7和MACK1细胞中，A. platensis水解物尽管抗氧化活性较低，却表现出更强的促增殖效果，提示可能存在其他信号通路（如PI3K/Akt/mTOR）的激活。研究未进行通路特异性分析，但鉴定出的色肽（尤其是富含碱性氨基酸的短肽）可能通过增强细胞黏附、膜通透性或螯合金属离子发挥作用。此外，MACK1细胞对低血清培养的耐受性较差，未来需逐步适应。结论部分翻译如下：本研究采用全面的筛选策略，评估了藻类和蓝细菌蛋白水解物，以确定最有前景的血清降低补充剂候选物。P. haitanensis水解物在CHO-K1细胞中表现出最高的促生长活性，与其较高的抗氧化能力一致；相反，A. platensis水解物对QM7和MACK1细胞具有刺激生长作用。这两种细胞系的相似反应可能与其共同的肌源性特征有关，但需进一步研究确认。此外，对水解物肽组成和氨基酸序列的分析，为与促进或维持细胞生长和增殖相关的潜在生物活性色肽提供了初步见解。尽管水解物的抗氧化活性暗示其潜在生物效应，但本研究未包括通路特异性分析（如ERK/MAPK、PI3K/AKT、mTOR信号）、氧化应激和凋亡/增殖标志物或基于组学的分析，这些需要更复杂的实验设计。未来研究可使用纯化或合成的色肽结合通路分析，以深入揭示细胞层面的作用机制。总体上，这些发现有助于开发用于可持续细胞培养肉和海鲜生产的改进培养基配方。
