《Foods》：Unraveling the Microbial Associations of Volatile Flavor Profiles in Spontaneously Fermented Camel Milk from Three Regions of Xinjiang, China
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新疆自然发酵骆驼奶因其营养而受到重视，但由于复杂的微生物生态系统，其质量不一致。研究人员调查了区域微生物群落如何与挥发性风味特征相关。来自三个不同地区——达坂城、哈密和柯坪的九个样本，使用细菌16S rRNA基因和真菌ITS区域扩增子测序（Amplicon S
新疆自然发酵骆驼奶因其营养而受到重视，但由于复杂的微生物生态系统，其质量不一致。研究人员调查了区域微生物群落如何与挥发性风味特征相关。来自三个不同地区——达坂城、哈密和柯坪的九个样本，使用细菌16S rRNA基因和真菌ITS区域扩增子测序（Amplicon Sequencing）结合全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF MS）进行分析。细菌群落以厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为主，而真菌中则以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主。优势属因地区而异：达坂城为乳酸杆菌属（Lactobacillus）和德克酵母属（Dekkera）；哈密为乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双足囊菌属（Dipodascus）；柯坪为乳酸球菌属（Lactococcus）和丝孢酵母属（Cutaneotrichosporon）。风味特征也不同，达坂城富含酯类、醇类和酮类；哈密以烃类和醇类为特征；柯坪含有较高的烃类、醇类和酯类。确定了关键的统计关联：乳酸杆菌属（Lactobacillus）、拉恩氏菌属（Rahnella）和醋杆菌属（Acetobacter）与丙烯（propene）和3-癸炔-2-醇（3-decyn-2-ol）呈正相关（VIP>1.0，|r|>0.8），而假单胞菌属（Pseudomonas）、乳酸球菌属（Lactococcus）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）与己酸乙烯酯（vinyl n-caproate）呈负相关。这些发现揭示了地理起源、特定微生物类群和风味属性之间的统计关联，为未来开发针对性的发酵剂培养物（starter cultures）提供了科学基础，但需进行微生物分离和功能验证。
**研究背景与问题**
自然发酵骆驼奶是新疆地区特有的传统乳制品，因其高营养价值（如高乳糖、高不饱和脂肪酸）和潜在益生菌特性而备受关注。然而，其生产仍以家庭作坊式手工工艺为主，依赖自然发酵，导致微生物生态系统复杂、产品风味和质量不稳定，严重阻碍了标准化和商业化进程。目前，针对发酵骆驼奶的研究多集中于基础微生物群落表征，缺乏系统阐明不同地理区域微生物群落如何驱动特定挥发性风味特征形成的机制研究。尤其是在新疆不同产区（如达坂城、哈密、柯坪），环境条件（温度、湿度）和发酵工艺（容器类型、是否使用回接种）的差异可能塑造独特的微生物群落，进而影响风味代谢途径。因此，亟需通过整合微生物组学和代谢组学，解析地理起源、微生物组装与风味特征之间的关联，为开发靶向发酵剂和标准化工艺提供理论基础。
**研究内容与结论**
研究人员从新疆三个代表性产区（达坂城、哈密、柯坪）各采集3份自然发酵骆驼奶样本（共9份，来自不同家庭生产者），采用细菌16S rRNA基因（V3-V4区）和真菌ITS1区域扩增子测序（Illumina NovaSeq 6000平台）分析微生物群落结构，同时结合顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱（HS-SPME-GC×GC-TOF MS）鉴定挥发性风味化合物。通过主成分分析（PCA）、偏最小二乘回归（PLSR）和Spearman相关性分析，揭示了区域特异性微生物群落与风味特征之间的统计关联。研究发现：达坂城样本富含酯类、醇类和酮类，哈密以烃类和醇类为主，柯坪以烃类、醇类和酯类为主，其中2,3-丁二酮（2,3-butanedione）是贡献黄油味的关键风味化合物（ROAV>100）。关键菌属如乳酸杆菌（Lactobacillus）、醋杆菌（Acetobacter）与丙烯和3-癸炔-2-醇呈正相关，而假单胞菌（Pseudomonas）与酯类呈负相关，表明这些微生物可能通过代谢途径直接或间接影响风味形成。该研究发表于《Foods》，首次从区域比较视角系统阐明了微生物群与风味特征的关联，为后续分离功能菌株、构建合成微生物群落（SynComs）及开发商业发酵剂提供了科学依据。
**主要技术方法**
研究人员采用的关键技术方法包括：（1）样本采集：来自新疆达坂城、哈密、柯坪三个地区，每个地区3份样本，共9份，由不同家庭生产者通过传统自然发酵制备。（2）微生物组分析：基于Illumina NovaSeq 6000平台对细菌16S rRNA基因（V3-V4区）和真菌ITS1区域进行扩增子测序，通过QIIME2流程进行序列处理，生成扩增子序列变异（ASVs），并计算alpha多样性（Chao1、Shannon指数）和beta多样性（基于Bray-Curtis距离的PCoA）。（3）挥发性风味分析：采用HS-SPME结合GC×GC-TOF MS，使用DB-HeavyWax（一维）和Rxi-5Sil MS（二维）色谱柱，NIST 2020库鉴定化合物，并计算相对气味活度值（ROAV）。（4）统计分析：通过PCA、PLSR（变量重要性投影VIP>1.0）和Spearman等级相关（|r|>0.8，校正p<0.05）评估微生物与风味物质的关联。
**研究结果**
**3.1 细菌微生物群落组成差异分析**
通过16S rRNA测序发现，所有样本共有1114个OTU，仅3个OTU共享，达坂城、哈密、柯坪分别有337、391、383个特有OTU。alpha多样性分析显示，柯坪样本的Chao1和Shannon指数均值最高，哈密最低；Pielou均匀度在柯坪和达坂城显著高于哈密（p=0.018）。beta多样性（PCoA）显示区域间显著分离（PCoA1解释63.7%方差），柯坪样本聚集紧密，哈密和达坂城样本分散。门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势门。属水平上，达坂城以乳酸杆菌（Lactobacillus, 60.44%）、乳酸球菌（Lactococcus, 14.66%）和拉恩氏菌（Rahnella, 12.06%）为主；哈密以乳酸杆菌（32.27%）、乳酸球菌（28.86%）和假单胞菌（Pseudomonas, 12.56%）为主；柯坪以乳酸球菌（43.80%）和沙雷氏菌（Serratia, 16.01%）为主。
**3.2 真菌群落组成差异分析**
通过ITS测序，共检测到233个OTU，3个共享，达坂城、哈密、柯坪分别有49、45、136个特有OTU。alpha多样性显示柯坪真菌丰富度和多样性最高，Pielou均匀度在柯坪和达坂城显著高于哈密（SD=0.018）。PCA显示区域分离（PCoA1解释28.2%方差），达坂城样本聚集紧密，哈密和柯坪样本分散。门水平上，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为优势门。属水平上，达坂城以德克酵母（Dekkera, 54.49%）、念珠菌（Candida, 16.45%）和哈萨克斯坦酵母（Kazachstania, 11.35%）为主；哈密以哈萨克斯坦酵母（27.12%）和库兹曼氏酵母（Kurtzmaniella, 22.31%）为主；柯坪以丝孢酵母（Cutaneotrichosporon, 18.06%）和双足囊菌（Dipodascus, 14.96%）为主。
**3.3 风味化合物组成差异分析**
通过GC×GC-TOF MS鉴定出大量挥发性化合物：哈密样本数量最多（266个特有），达坂城次之，柯坪最少（145个特有）。化合物类别包括醇类、醛类、羧酸类、酯类、杂环类、烃类和酮类。达坂城富含酯类、烃类、醇类和酮类；哈密以烃类和醇类为主；柯坪以烃类、醇类和酯类为主。ROAV分析显示，2,3-丁二酮（2,3-butanedione）在所有样本中ROAV最高（>100），贡献黄油味；其他关键化合物包括2-戊基呋喃（2-pentylfuran）、(E)-2-壬烯醛（(E)-2-nonenal）等。哈密样本有9种关键化合物（ROAV≥1），达坂城和柯坪各4种。感官描述雷达图显示，甜味、果味和青草味是主要特征。PCA显示柯坪与达坂城/哈密样本分离（PC1+PC2解释69.3%方差）。通过ANOVA和VIP>1筛选出37种差异化合物，热图显示达坂城和哈密含量较高。成对比较中，达坂城vs哈密有88种差异化合物（32种上调，56种下调），达坂城vs柯坪有92种（70种上调），哈密vs柯坪有82种（70种上调）。
**3.4 微生物群落与风味化合物相关性分析**
通过PLSR分析（以top10细菌属为自变量，风味物质为因变量），结果显示：己酸乙烯酯（vinyl n-caproate）与假单胞菌（Pseudomonas）、乳酸球菌（Lactococcus）和克雷伯氏菌（Klebsiella）显著负相关；丙烯（propene）和3-癸炔-2-醇（3-decyn-2-ol）与乳酸杆菌（Lactobacillus）、拉恩氏菌（Rahnella）和醋杆菌（Acetobacter）显著正相关。真菌方面，己酸乙烯酯与丝孢酵母（Cutaneotrichosporon）、双足囊菌（Dipodascus）和尤登氏酵母（Udeniomyces）显著负相关；丙烯和3-癸炔-2-醇与克鲁维酵母（Kluyveromyces）、念珠菌（Candida）、哈萨克斯坦酵母（Kazachstania）和毕赤酵母（Pichia）显著正相关。德克酵母（Dekkera）和赛伯林德勒氏酵母（Cyberlindnera）未显示明显相关性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，区域微生物差异可能源于环境选择压力（如温度、湿度）和发酵工艺（如容器材料、回接种）的协同作用。达坂城（凉爽湿润）富集了嗜冷菌（如拉恩氏菌）和德克酵母；哈密（干热）假单胞菌丰度高；柯坪（传统回接种）乳酸球菌和沙雷氏菌占优。PLSR模型揭示了关键微生物属对风味物质的贡献：乳酸杆菌与2,3-丁二酮正相关，支持其通过糖酵解产生丙酮酸进而生成双乙酰的代谢途径；醋杆菌可能通过氧化乙醇生成乙醛和乙酸参与酯形成；假单胞菌因分泌脂肪酶和蛋白酶加速脂肪酸氧化，导致与酯类负相关。酵母通过埃利希途径（Ehrlich pathway）将支链氨基酸转化为高级醇和酯。研究还强调了功能菌株（如Gluconacetobacter rhaeticus、Kazachstania pseudohumilis）的潜在作用，但需通过纯培养实验验证。局限性包括：未分离菌株进行发酵验证，未考虑非微生物因素（如骆驼品种、饲料），GC-MS仅检测部分挥发性物质。未来方向包括构建合成微生物群落（SynComs）和整合感官评价。
**研究结论**
该研究对新疆达坂城、哈密和柯坪地区的自然发酵骆驼奶进行了微生物多样性及群落结构的全面分析，并探讨了其与挥发性风味化合物的关联。结果表明，细菌和真菌群落均呈现显著的区域差异。细菌方面，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势门，但优势属不同：达坂城以乳酸杆菌（Lactobacillus）、乳酸球菌（Lactococcus）和拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）为主；哈密以乳酸杆菌、乳酸球菌和假单胞菌（Pseudomonas fragi）为主；柯坪以乳酸球菌、沙雷氏菌（Serratia）和克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）为主。关键微生物属（如乳酸杆菌、乳酸球菌、醋杆菌、假单胞菌、德克酵母）与特定挥发性化合物显著相关。功能菌株如产醋酸的Gluconacetobacter rhaeticus仅在达坂城样本中发现，暗示其可能参与区域风味塑造。真菌群落同样具有区域特异性：达坂城以德克酵母（Dekkera anomala）为主（相对丰度>54%），哈密以哈萨克斯坦酵母（Kazachstania）为主，柯坪以丝孢酵母（Cutaneotrichosporon）为主。挥发性风味分析证实，微生物群落结构的差异对应不同的代谢特征：达坂城样本富含酯类、醇类和酮类，哈密和柯坪以烃类和醇类为主。通过相对气味活度值（ROAV）分析，鉴定出11种关键气味化合物（ROAV≥1），其中2,3-丁二酮（2,3-butanedione）在所有样本中贡献最大。哈密样本含有最多关键气味化合物（9种），远超达坂城和柯坪（各4种）。偏最小二乘回归（PLSR）模型成功建立了特定微生物类群与关键风味物质之间的定量关系：细菌中，乳酸杆菌、拉恩氏菌和醋杆菌与丙烯和3-癸炔-2-醇呈正相关，表明其可能直接参与这些风味生成；假单胞菌、乳酸球菌和克雷伯氏菌与多种酯类呈负相关，提示存在代谢竞争或底物利用。真菌中，克鲁维酵母、念珠菌和哈萨克斯坦酵母与多种特征风味化合物显著相关，而高丰度的德克酵母未显示明显关联，表明真菌对风味形成的贡献可能更依赖于特定代谢活性而非单纯数量丰度。总之，该研究系统描绘了地理起源与微生物群落结构之间的关联，表明区域环境影响和传统发酵工艺共同塑造了独特的微生物群落，进而驱动区域特异性挥发性风味模式的形成。这些发现为传统发酵乳制品中微生物群、代谢物与风味之间的相互作用提供了新视角，并为未来构建合成微生物群落（SynComs）和开发商业发酵剂奠定了科学基础，推动了自然发酵骆驼奶的标准化、质量控制和工业化生产。
