《International Journal of Molecular Sciences》：Identification of Cellular Senescence-Related Hub Genes in Rheumatoid Arthritis from Bioinformatics Analysis Through Machine Learning up to Verifications in Mouse Macrophages and Tests in Patients
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类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜炎症和关节破坏为特征的慢性自身免疫性疾病。细胞衰老（cellular senescence）与慢性炎症相关，但RA中关键的衰老相关调节因子仍不清楚。本研究旨在识别RA的衰老相关特征及其作用。研究人员以GSE89408作为训练队列
类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜炎症和关节破坏为特征的慢性自身免疫性疾病。细胞衰老（cellular senescence）与慢性炎症相关，但RA中关键的衰老相关调节因子仍不清楚。本研究旨在识别RA的衰老相关特征及其作用。研究人员以GSE89408作为训练队列，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和三种机器学习算法取差异表达基因与衰老相关基因的交集筛选核心基因，并以GSE55457作为外部验证队列。分析了免疫浸润、调控网络、亚型和药物预测。通过临床和体外实验验证了受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（RIPK2）在巨噬细胞衰老样表型中的表达和功能，并进行了初步信号通路探索。鉴定出三个衰老相关核心基因（肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（TNFAIP6）、溶质载体家族2成员3（SLC2A3）、RIPK2）。基于此构建的列线图表现出稳健的诊断效能（AUC=0.988）。核心基因与髓系细胞，尤其是巨噬细胞，呈强相关性。识别出两种免疫学上不同的RA亚型。RIPK2在临床样本中表达上调；抑制RIPK2减弱了脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞衰老样变化和炎症。初步数据表明RIPK2可能通过核因子κB（NF-κB）通路发挥作用。本研究识别了RA的衰老相关特征，揭示了RIPK2连接固有免疫与巨噬细胞衰老样变化，为发病机制提供了新见解，并支持其作为候选生物标志物和治疗靶点。
**研究背景**
类风湿关节炎（RA）是一种以对称性多关节侵蚀性炎症为特征的慢性自身免疫性疾病，全球患病率约0.5%–1%。其发病机制复杂，涉及遗传、环境和免疫失调等因素，其中免疫细胞异常激活及炎症因子风暴是核心病理特征。尽管近年来RA诊断和治疗取得显著进展，部分患者对现有疗法反应不佳，且缺乏早期诊断的特异性生物标志物。细胞衰老（cellular senescence）以稳定的细胞周期停滞、代谢改变及获得衰老相关分泌表型（SASP）为特征，已成为连接衰老、慢性炎症与免疫失调的重要生物学过程。研究发现，衰老细胞可通过分泌促炎细胞因子、趋化因子和基质重塑因子主动重塑组织微环境，参与自身免疫性和炎症性疾病。在RA中，滑膜成纤维细胞和免疫细胞中均观察到衰老相关改变，提示衰老相关机制可能参与炎症放大和关节破坏。然而，RA中调控细胞衰老的关键基因及其与免疫功能障碍之间的分子机制仍不清楚。为此，研究人员整合转录组分析、细胞衰老相关基因谱、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习方法，旨在识别RA中衰老相关核心基因，并探索其免疫微环境特征及临床意义。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**主要关键技术方法**
研究人员从GEO数据库获取RA滑膜基因表达数据集（GSE89408作为训练队列，GSE55457作为外部验证队列），采用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），通过WGCNA构建共表达网络并识别与RA最相关的模块。利用三种机器学习算法（LASSO回归、随机森林、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE））对候选基因进行特征选择，取交集获得核心基因。随后进行免疫浸润分析（ssGSEA）、调控网络构建、共识聚类亚型分析及药物预测。实验验证部分包括：收集10例RA患者和10例年龄、性别匹配的健康对照的外周血样本，检测RIPK2 mRNA表达及血浆炎症因子水平；在RAW264.7小鼠巨噬细胞中利用siRNA敲低RIPK2，通过qPCR、ELISA、Western blot和SA-β-gal染色评估巨噬细胞衰老样表型和炎症反应。
**研究结果**
**2.1 研究设计**：研究人员从GSE89408和GSE55457数据集共218个滑膜样本中选取28例正常滑膜组织和95例确诊RA样本用于后续分析。
**2.2 差异表达基因鉴定**：在RA数据集中共鉴定出6585个DEGs（padj<0.05, |log2FC|>0.5），火山图和热图展示了差异表达模式。
**2.3 WGCNA关键模块识别**：以软阈值10构建无尺度共表达网络，层次聚类将基因分为多个模块。棕色模块（含543个基因）与RA表型相关性最强（模块成员与基因显著性相关系数r=0.74, p=3×10
-95）。
**2.4 机器学习筛选核心基因**：取DEGs、衰老相关基因及WGCNA棕色模块基因的交集获得96个候选基因。LASSO、随机森林和SVM-RFE三种方法筛选的特征基因取交集，最终得到三个核心基因：TNFAIP6、SLC2A3和RIPK2。
**2.5 表达验证与诊断效能**：在训练队列中，三个核心基因在RA组表达均显著高于对照组（p<0.0001），ROC曲线下面积（AUC）分别为TNFAIP6 0.967、SLC2A3 0.981、RIPK2 0.959。在外部验证队列中，仅RIPK2在RA组仍显著上调（p<0.01），AUC为0.900，而TNFAIP6和SLC2A3诊断效能中等。RIPK2在独立数据集中表现出最稳定的诊断性能。
**2.6 诊断价值评估**：基于三个核心基因构建列线图预测模型，AUC达0.988，校准曲线拟合良好，决策曲线分析显示其临床净获益优于单基因预测。
**2.7 免疫细胞浸润与核心基因相关性**：ssGSEA分析显示RA组多种免疫细胞亚群富集分数显著升高，包括活化CD4
+/CD8
+ T细胞、1型/17型辅助T细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞。三个核心基因与多数免疫细胞亚群呈显著正相关，尤其与髓系固有免疫细胞（巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞）相关性一致。基因集变异分析（GSVA）显示RA中经典炎症通路（炎症反应、干扰素反应、IL-6/JAK/STAT3信号）显著富集。
**2.8 调控网络鉴定**：构建了miRNA和转录因子（TF）调控网络。SLC2A3和TNFAIP6受多个miRNA和关键炎症转录因子（如NFKB1、RELA）调控；RIPK2受miRNA（如hsa-miR-19a-5p）和转录因子（如CEBPB、CEBPD）双重调控。
**2.9 核心亚型鉴定**：基于三个核心基因表达谱进行共识聚类，将RA患者分为C1和C2两个亚型。C2亚型中三个核心基因表达均显著高于C1（p<0.0001），PCA可有效区分两亚型。GSEA显示两亚型在代谢通路、癌症通路和神经退行性疾病通路上显著差异。免疫浸润分析显示C2亚型具有更强的免疫激活表型。
**2.10 潜在小分子药物发现**：通过药物-基因相互作用网络筛选出潜在靶向药物，如TNFAIP6可与阿司匹林、塞来昔布、来氟米特、姜黄素等结合；SLC2A3候选药物包括格列美脲、槲皮素等；RIPK2与激酶抑制剂（如普纳替尼、厄洛替尼）相互作用。分子对接验证了塞来昔布与TNFAIP6（结合能-8.9 kcal/mol）、格列美脲与SLC2A3（结合能-10.5 kcal/mol）、普纳替尼与RIPK2（结合能-10.1 kcal/mol）的稳定结合。
**2.11 RIPK2表达与细胞衰老表型实验验证**：RA患者外周血白细胞中RIPK2 mRNA表达显著高于健康对照，血浆炎症因子水平升高，且RIPK2表达与炎症因子水平呈正相关趋势。在RAW264.7巨噬细胞中，RIPK2干预后衰老相关基因表达改变，LPS刺激后TNF-α和IL-1β分泌增加，SA-β-gal阳性细胞比例升高；Western blot证实RIPK2及衰老相关蛋白表达变化。
**2.12 RIPK2介导LPS诱导的巨噬细胞衰老样表型及炎症反应**：siRNA敲低RIPK2显著抑制LPS诱导的衰老相关基因（P16、P21、P53）和炎症因子（IL-6、TNF-α）mRNA上调，减少TNF-α和IL-1β分泌，降低SA-β-gal阳性细胞比例。Western blot显示LPS上调RIPK2、P16和磷酸化p65（p-p65）蛋白水平，而RIPK2敲低抑制这些变化，提示RIPK2可能通过调控NF-κB通路参与巨噬细胞衰老样变化和炎症反应。
**讨论与结论**
讨论部分总结了本研究的核心发现：通过整合转录组学、细胞衰老相关基因分析、WGCNA和三种机器学习算法，鉴定出三个衰老相关核心基因（TNFAIP6、SLC2A3、RIPK2）。其中RIPK2在独立验证队列中表现出最稳健的诊断效能，并被选为实验验证对象。功能实验进一步表明，RIPK2敲低可减轻LPS诱导的巨噬细胞衰老样表型和炎症反应，支持RIPK2在衰老相关免疫失调中的潜在作用。免疫浸润分析发现三个核心基因与髓系细胞（尤其是巨噬细胞）呈强相关性，结合RIPK2与NF-κB通路的关联，提示RIPK2可能连接固有免疫与衰老相关炎症重塑。此外，共识聚类识别出两种免疫特征不同的亚型，表明衰老相关分子特征可能贡献于疾病异质性。讨论也指出了研究局限性：转录组分析主要依赖公开数据集；仅实验验证了RIPK2；功能研究限于LPS刺激的RAW264.7细胞和临床外周血样本，缺乏原代人滑膜巨噬细胞和体内模型验证；NF-κB通路机制证据仍属初步；临床验证样本量小；数据集来源种族差异等。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究通过整合多种生物信息学方法和实验验证，在RA中鉴定出三个细胞衰老相关核心基因（TNFAIP6、SLC2A3和RIPK2）。其中，RIPK2因其突出的诊断性能、与免疫衰老通路的强相关性以及在调控网络中的核心地位，被选作进一步功能验证。研究人员证明RIPK2在RA中显著上调，并促进LPS诱导的巨噬细胞衰老样表型和炎症反应，而RIPK2敲低有效减弱这些效应。这些发现不仅从细胞衰老角度为RA发病机制提供了新见解，也提示RIPK2可作为RA有前景的诊断生物标志物和治疗靶点。需要更大样本量和体内模型的研究来验证RIPK2在RA中的临床转化价值。
