综述：乳腺癌中的MicroRNAs：生物学功能及实验与治疗应用的技术

《Cancers》：MicroRNAs in Breast Cancer: Biological Functions and Technologies for Experimental and Therapeutic Applications

　　

乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，仍然是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一。尽管在乳腺癌研究和治疗方面取得了显著进展，但疾病异质性、治疗耐药性和转移性进展仍然是有效疾病管理的主要障碍。在涉及乳腺癌的分子调控因子中，微小RNA（microRNAs, miRNAs）已被认为是基因表达的关键转录后调控因子，作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用。通过调控靶RNA的表达，miRNAs控制肿瘤起始和进展中的关键生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、血管生成、上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）、侵袭和转移。为了研究miRNA功能并探索其治疗潜力，已开发了多种调节miRNA表达的方法。这些包括功能获得策略，如miRNA模拟物（miRNA mimics）、miRNA表达载体和CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa），以及功能丧失方法，包括抗miRNA寡核苷酸（anti-miRNA oligonucleotides, AMOs）、miRNA海绵（miRNA sponges）、CRISPR-Cas9介导的基因敲除和CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）。本综述全面概述了miRNAs在乳腺癌中的生物学作用，并讨论了当前调节miRNA的技术、其分子机制、实验和治疗应用以及相关局限性。此外，它总结了miRNA递送系统的最新进展，包括病毒载体、有机纳米颗粒和无机纳米载体，强调了它们在提高递送效率、靶点特异性和促进临床转化方面的潜力。最后，综述讨论了未来前景，强调从单靶点干预向网络水平调控的转变，以及将基于miRNA的策略整合到精准肿瘤学中，以支持开发更有效的乳腺癌疗法。

论文主体部分总结如下：

**1. 引言**
乳腺癌因其高度分子异质性、频繁的治疗耐药性和晚期诊断而管理困难。尽管分子肿瘤学进展揭示了许多驱动肿瘤发展的关键调控分子，其中微小RNA（microRNAs, miRNAs）被报道为肿瘤发生的关键调控因子。这些小型非编码RNA在转录后水平通过调控多个靶RNA的表达，影响增殖、凋亡、血管生成、侵袭、转移和治疗抵抗等癌症相关过程。miRNA的异常表达在乳腺癌中常见，且常以亚型特异性方式发生，不仅促进肿瘤起始和进展，还贡献于疾病分子和表型异质性。miRNA作为致癌和抑癌通路的核心调控因子，使其成为有价值的诊断和预后生物标志物及治疗靶点。与针对单个分子的传统靶向治疗不同，基于miRNA的策略可通过恢复肿瘤抑制性miRNA或抑制致癌性miRNA，同时调控整个调控网络。因此，精准调控miRNA的技术已成为研究miRNA功能及治疗干预的重要工具，同时递送平台的发展（如病毒载体、有机纳米颗粒和无机纳米载体）解决了稳定性、靶向特异性和体内递送等挑战，推动了基于miRNA的治疗策略在精准肿瘤学框架下的应用。

**2. 乳腺癌的流行病学与分子图谱**
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一，其高度分子异质性导致肿瘤行为、临床结局和治疗反应差异显著。根据GLOBOCAN 2022数据，2022年全球新发乳腺癌约230万例，占所有癌症诊断的11.6%，是女性癌症相关死亡的第二大原因。预计到2040年，新发病例将超过300万，死亡人数接近100万。乳腺癌的分子分类基于受体表达状态，主要分为四个亚型：Luminal A（ER⁺, PR≥20%, HER2^-, Ki-67<20%）、Luminal B（ER⁺, HER2^+/-, PR<20%或Ki-67≥20%）、HER2阳性（ER^-, PR^-, HER2⁺）和三阴性乳腺癌（TNBC, ER^-, PR^-, HER2^-）。其中TNBC最具侵袭性，预后最差，可进一步分为六个亚型。miRNA表达模式在不同乳腺癌亚型中差异显著，反映了其分子和表型特征。在Luminal A亚型中，miR-30家族和miR-99a/let-7c/miR-125b簇与肿瘤抑制功能相关；Luminal B亚型中miR-182-5p、miR-200b-3p等上调；HER2阳性亚型中miR-125b和miR-4728-3p上调，与HER2驱动信号相关；TNBC亚型中miR-17-5p、miR-20a-5p等上调，且表现出高度异质性。亚型特异性miRNA表达对治疗开发具有重要意义，需采用亚型特异性靶向策略。

**3. miRNAs在乳腺癌中的生物学作用**
miRNAs通过识别靶mRNA的3'非翻译区（3'UTR）中的部分互补序列，促进mRNA降解或抑制翻译，从而调控蛋白表达。在乳腺癌中，miRNAs可作为致癌基因或肿瘤抑制因子，参与细胞增殖、凋亡、血管生成、迁移、侵袭、EMT和转移等过程。
**3.1 细胞增殖与存活**：多种miRNAs调控乳腺癌细胞增殖。致癌性miRNAs如miR-4472通过降低RGMA mRNA水平、miR-92a-3p通过抑制BTG2、miR-155-5p通过抑制NDFIP1激活NF-κB信号，促进增殖。肿瘤抑制性miRNAs如miR-362-3p靶向hERG、miR-874-3p靶向VDAC1、miR-379-5p靶向KIF4A、miR-205-5p抑制Wnt/β-catenin通路、miR-516a-3p靶向PYGO2、miR-449c-5p靶向ERBB2抑制JAK/STAT信号、miR-16-5p靶向ANLN、miR-214-3p靶向B7H3、miR-26b-5p靶向MYCBP等，抑制增殖。
**3.2 凋亡**：miRNAs通过调控PI3K/Akt等信号通路影响凋亡。miR-641靶向NUCKS1抑制PI3K/Akt，促进凋亡；miR-944靶向SPP1具有类似作用；miR-548k通过激活PI3K/Akt抑制凋亡；miR-21抑制FASLG、PDCD4、PTEN等促凋亡靶点；miR-216b靶向HK2抑制mTOR，促进自噬相关细胞死亡；miR-34a通过降低SIRT1增强p53介导的凋亡；miR-26a靶向MTDH和EZH2促进凋亡。致癌性miRNAs如miR-125b靶向BAK1、miR-221/222靶向PUMA、CASP3和p27Kip1，抑制凋亡。
**3.3 肿瘤血管生成**：miRNAs调控血管生成。miR-146a-5p上调CCNB1、miR-526b和miR-655上调VEGF-A等促进血管生成；miR-573和miR-578在BRCA1/2相关乳腺癌中下调导致血管生成增加；缺氧条件下SNHG1抑制miR-199a-3p，上调TFAM促进血管生成。抗血管生成miRNAs包括miR-204下调VEGF-A和CTNNB1、miR-140-5p直接靶向VEGF-A、miR-126降低VEGF-A、miR-195靶向IRS1、miR-212-3p靶向SP1抑制VEGF-A。
**3.4 细胞迁移与侵袭**：miRNAs通过调控MAPK、STAT3、Wnt/β-catenin、TGF-β等信号通路影响迁移和侵袭。肿瘤抑制性miRNAs如miR-1260b通过CCDC134/MAPK、miR-556-5p靶向PTHLH、miR-142-5p靶向DNMT1激活SERPINB5、miR-337-3p靶向ESRP1、miR-518a-5p靶向ZEB2、miR-138-5p靶向RHBDD1、miR-125b-5p靶向KIAA1522、miR-135a-5p靶向BAG3、miR-148a靶向WNT1、miR-548m靶向AHR逆转EMT。致癌性miRNAs如miR-30d靶向KLF11激活STAT3、miR-532-5p靶向RERG激活MAPK/ERK。外泌体miR-7-5p靶向RYK抑制EMT。
**3.5 转移性播散与定植**：转移是多步骤过程，miRNAs通过调控EMT、代谢重编程等发挥关键作用。致癌性miRNAs如miR-7641通过外泌体促进转移、miR-223-3p靶向FBXW7、miR-934抑制PTEN激活PI3K/Akt、外泌体miR-122-5p靶向MKP-2激活MAPK。肿瘤抑制性miRNAs如miR-328-3p靶向CPT1A抑制脂肪酸β氧化、miR-4638-3p靶向ATF3抑制骨转移、miR-606靶向STC1、miR-199a-5p靶向SP1抑制LOXL2、miR-206靶向TWF1抑制IL11转录。let-7/LIN28/NF-κB/IL-6轴和miR-93-5p、miR-520c等通过靶向MKL1和STAT3抑制EMT和转移。

**4. 乳腺癌研究中调控miRNA表达的策略**
针对miRNA的异常表达，已开发多种策略进行调控，包括恢复肿瘤抑制性miRNA和抑制致癌性miRNA。
**4.1 miRNA替代方法**：通过传递合成miRNA模拟物（miRNA mimics）或使用质粒/病毒载体表达肿瘤抑制性miRNA。miRNA mimics是双链RNA寡核苷酸，模拟内源性成熟miRNA，引导链进入RISC复合物抑制靶mRNA。在乳腺癌研究中，miR-641、miR-337-3p、miR-126、miR-653-5p、miR-16-5p、miR-874-3p等mimics被用于研究功能。miRNA编码表达载体通过质粒或病毒载体表达前体miRNA，经内源加工产生成熟miRNA，如miR-143、miR-5096、miR-30b、miR-34a等。
**4.2 miRNA抑制策略**：包括miRNA海绵（miRNA sponges）、抗miRNA寡核苷酸（AMOs）和CRISPR-Cas系统。miRNA海绵是含有多个miRNA结合位点的RNA转录本，竞争性结合内源miRNA，如靶向miR-10b、miR-21的海绵，以及环状RNA（circRNA）海绵如circ-21。AMOs是合成寡核苷酸，通过化学修饰（如2′-O-甲基、锁核酸（LNA）等）增强稳定性，如LNA-anti-miR-19-3p、LNA-anti-miR-142-3p、LNA-anti-miR-32-5p等。CRISPR-Cas系统通过Cas9介导的基因组敲除或Cas13介导的RNA靶向调控miRNA，如CRISPR-Cas9敲除miR-23b/27b、miR-3662等。
**4.3 表观遗传与转录调控**：CRISPR-dCas9平台通过融合激活域（如VP64、VPR、p300、TET1）或抑制域（如KRAB、DNMT3A）实现转录激活（CRISPRa）或抑制（CRISPRi），不改变DNA序列。在乳腺癌中，CRISPR-dCas9-TET1系统激活miR-200c抑制肿瘤，CRISPR-dCas9-KRAB沉默miR-3662抑制TNBC生长。尽管CRISPR技术具有潜力，但面临体内递送、脱靶效应和免疫原性等挑战。

**5. 基于miRNA的治疗及其与标准乳腺癌治疗的整合**
基于miRNA的治疗策略包括miRNA替代（如miR-34a模拟物MRX34进入临床试验）和miRNA抑制。miR-34a调控30多个致癌基因，脂质体包裹的MRX34在I期试验中显示可行性和初步抗肿瘤活性，但因免疫相关不良反应终止。其他miRNA模拟物如miR-497、miR-544、miR-603、miR-203在异种移植模型中显示抗肿瘤效果。miRNA抑制策略如AMOs靶向miR-21和miR-155与光动力疗法联用增强TNBC疗效。miRNA调节与化疗、放疗、靶向治疗联用可增强疗效，如miR-34a与舒尼替尼或阿霉素联用、miR-190增强内分泌治疗敏感性、miR-126恢复增强曲妥珠单抗敏感性。但临床转化受限于miRNA稳定性、递送效率、靶向特异性和免疫毒性。

**6. miRNA治疗递送平台的进展**
递送系统分为病毒和非病毒两类。
**6.1 病毒介导的递送**：包括γ-逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）。慢病毒载体可实现稳定整合和长期表达，但存在插入突变风险。AAV载体免疫原性低、表达持久，但包装容量有限。HSV-1载体容量大，主要呈游离状态。在乳腺癌研究中，慢病毒递送miR-34a/NOTCH1轴、anti-miR-29a、miR-100、miR-99a等显示抗肿瘤作用；腺病毒载体可结合miRNA响应元件实现肿瘤选择性表达；AAV载体用于双靶向递送和联合治疗。
**6.2 非病毒递送方法**：包括有机纳米颗粒和无机纳米颗粒。有机纳米颗粒主要有脂质基纳米载体（如脂质体、脂质纳米颗粒（LNPs））和聚合物纳米颗粒（如PLGA、PEI）。脂质基纳米载体已成功递送miR-6838-5p、miR-451、miR-22-3p、miR-603等，在体内抑制肿瘤生长。聚合物纳米颗粒如PLGA-PEG、PEI等，可修饰靶向配体，实现协同递送，如miR-34a和anti-miR-10b、anti-miR-21和表柔比星等。植物来源外泌体样纳米囊泡（PELNVs）具有低免疫原性、高稳定性，如Brucea javanica来源的BF-Exos递送miRNAs抑制TNBC，但存在装载效率和批次差异等挑战。无机纳米颗粒如金纳米颗粒（AuNPs）用于递送miR-206、miR-708等，显示良好安全性和抗肿瘤效果。

**7. 未来展望：从网络调控到精准肿瘤学**
未来重点在于识别和验证亚型特异性miRNA调控网络，整合多组学数据和人工智能/机器学习方法解析复杂miRNA-mRNA相互作用。改进递送技术、开发联合治疗策略（如与化疗、免疫治疗、内分泌治疗联用）以及利用CRISPR等基因组工程工具实现可逆、精准的miRNA调控，将推动基于miRNA的策略在精准肿瘤学中的应用，实现更精确的疾病分类和个性化治疗。

**8. 结论**
miRNA研究将从个体miRNA转向复杂调控网络的重建与分析，需要更精确的实验和计算工具，以及基础研究与临床实践的紧密结合。将miRNA生物学整合到精准肿瘤学框架中，有望实现更准确的疾病分类和个性化治疗策略的开发。