低水平DNAJB1::PRKACA融合激酶的检测需要利用敏感检测方法与周密的方法学规划。对Palaz等人“独立多队列RNA-Seq分析不支持肝母细胞瘤或胆道闭锁中存在复发性DNAJB1::PRKACA融合”的回复。对“Fleifil等人. DNAJB1-PKAc激酶在年轻小儿肝癌患者中表达并增强致癌通路. Cancers 2025, 17, 83”的评论

《Cancers》：Detection of Low Levels of DNAJB1::PRKACA Fusion KinaseRequires the Utilization of Sensitive Assays and CarefulMethodological Planning. Reply to Palaz et al. Independent Multi-Cohort RNA-Seq Analysis Does Not Support Recurrent DNAJB1::PRKACA Fusion in Hepatoblastoma or Biliary Atresia. Comment on “Fleifil et al. DNAJB1-PKAc Kinase Is Expressed in Young Patients with Pediatric Liver Cancers and Enhances Carcinogenic Pathways. Cancers 2025, 17, 83”

　　

2024年，研究人员发表了一篇论文，描述了在患有侵袭性肝母细胞瘤（HBL）和胆道闭锁（BA）的年轻患者中鉴定出DNAJB1::PRKACA融合激酶。在研究中，研究人员使用了敏感的分子和细胞技术，发现约70%分析的HBL样本表现出不同水平的DNAJB1::PRKACA表达。总共有15–20%的融合阳性HBL样本具有与在纤维板层肝细胞癌（FLC）中观察到的水平相当的DNAJB1::PRKACA水平，而其余样本表现出较低的激酶水平。Palaz等人使用Arriba分析了五个HBL数据集和一个BA RNA-Seq数据集，未发现DNAJB1::PRKACA融合转录本。基于他们的分析，作者得出结论，DNAJB1::PRKACA在HBL患者中不表达。他们进一步指出，在HBL或BA中鉴定DNAJB1::PRKACA融合需要正交分子验证，以在DNA或RNA水平上确认融合事件。因此，研究人员对来自几个融合阳性HBL样本和三个BA样本的RT-PCR产物进行了Sanger测序。HBL和BA病例均显示存在DNAJB1::PRKACA融合转录本，与在FLC中检测到的相同。这些结果验证了DNAJB1::PRKACA存在于一些HBL和BA患者中，正如使用敏感的分子和细胞技术已经证明的那样。对当前RNA-Seq数据进行Arriba分析可能不足以检测HBL病例中低水平的DNAJB1::PRKACA，特别是当它们与融合阴性HBL标本混合时。因此，研究人员发现几种独立的方法，如免疫分析和RT-PCR测序，可以有效检测HBL和BA病例中的DNAJB1::PRKACA。该研究还强调，检测低水平的DNAJB1::PRKACA需要在同一研究中对HBL和BA患者进行个体分析，并使用FLC作为对照。

纤维板层肝细胞癌（FLC）是一种多发于青少年和年轻成年人的肝癌，目前除手术切除外尚无有效的治疗方法。既往研究表明，FLC与一段400 kb的DNA片段缺失有关，该缺失导致DNAJB1::PRKACA融合蛋白的形成，并在小鼠模型中证实了这一融合激酶在FLC发生中的关键作用。然而，也有报道指出FLC的发生可能不依赖该融合激酶，过表达天然PRKACA也能产生类似FLC的转录组特征。此外，尽管DNAJB1::PRKACA在FLC患者中高表达，但并非FLC所特有，在导管内嗜酸性胰腺肿瘤（IOPNs）等非FLC癌症中也有检出。因此，将DNAJB1::PRKACA作为FLC的特异性标志物需谨慎。研究人员前期在《Cancers》杂志上发表研究，指出在侵袭性肝母细胞瘤（HBL）和胆道闭锁（BA）的年轻患者中也存在该融合激酶。然而，Palaz等人使用Arriba工具分析了公共RNA-Seq数据集，未能发现该融合转录本，并得出HBL患者不表达该融合的结论。为解决这一争议，验证前期发现并探讨检测方法学上的局限性，研究人员开展了进一步研究，以明确低水平DNAJB1::PRKACA的检测条件及其在非FLC癌症中的存在情况。这项研究对于全面理解该融合激酶的病理作用及指导临床精准检测具有重要意义，论文发表在《Cancers》。

研究人员主要采用了逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）结合Sanger测序技术，对前期报道的HBL和BA样本队列以及新收集的HBL和肝细胞癌，非其他特指型（HCN-NOS）样本进行融合转录本验证。同时，利用针对融合蛋白的特异性抗体（Fus-Abs）进行免疫荧光染色与共聚焦显微镜分析，定位并定量肿瘤样本中融合激酶的表达。此外，运用NCBI BLAST分析和生物信息学翻译程序对转录本编码的氨基酸序列进行了比对验证。

Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma (FLC): Fusion Kinase DNAJB1::PRKACA Is Expressed in FLC Patients but Is Also Detected in Other Cancers
通过文献回顾与理论分析得出结论，FLC中DNAJB1::PRKACA融合激酶高表达，但也存在于其他非FLC癌症中。多项研究在IOPNs等肿瘤中检测到该融合，表明其并非FLC独有，在将其作为FLC标志物时应保持谨慎。

Sanger Sequencing of RT-PCR Products Confirmed the Expression of DNAJB1::PRKACA in HBL Patients and in Patients with Biliary Atresia
研究人员对三个前期报道为融合阳性的HBL病例及三个BA样本进行了RT-PCR产物的Sanger测序。结果显示，这些HBL患者携带着与FLC患者相同的融合转录本；在BA患者中也检测到了与FLC肺转移病灶转录本一致的融合序列。这从分子水平确证了DNAJB1::PRKACA在HBL和BA患者中的存在。

RT-PCR-Sequencing and Immunostaining Analyses Revealed That DNAJB1::PRKACA Is Detected in Liver Tumors of Recently Collected Specimens from HBL and HCN-NOS Patients
对新收集的HBL和HCN-NOS患者样本进行RT-PCR测序，发现其序列与FLC对照相匹配，均包含融合区域。免疫染色分析发现，DNAJB1::PRKACA定位于细胞核内，并与核标记物RNA聚合酶I（RPA194）共定位。定量分析表明，在融合阳性的HBL/HCN-NOS肿瘤中，约38%的细胞表现为核内DNAJB1::PRKACA阳性，而FLC肿瘤中该比例约为70-80%。

RNA Transcripts of the Fusion-Positive HBL-HCN-NOS and BA Patients Code for Amino Acid Peptide That Is in Use for Trial Phase 1 for FLC Patients
通过NCBI BLAST分析发现，融合转录本在GTG位点连接DNAJB1和PRKACA序列，编码缬氨酸作为连接氨基酸。这些转录本翻译产生的短融合肽序列，此前已被用于制备Fus-Abs，并作为疫苗应用于针对FLC的1期临床试验中，这为临床试验和抗体生成提供了分子层面的支持。

Limitations of Combining HBL and BA RNA-Seq Datasets Generated with Different Designs
通过方法学对比分析得出结论，Palaz等人未能检测到融合的原因在于RNA-Seq数据集的设计差异。用于基因表达分析的RNA-Seq通常使用短读长，而融合检测需要更长的双端读长。此外，Arriba工具在融合检测上的灵敏度不如CICERO等程序。更重要的是，HBL和BA样本具有高度异质性，包含融合阴性和低水平表达的病例，使用针对基因表达分析设计的数据集难以检测到低水平的融合事件。

在讨论部分，研究人员总结了Palaz等人未能检测到DNAJB1::PRKACA的主要原因，即分析了最初用于基因表达而非融合检测的异质性HBL RNA-Seq数据集，且未考虑样本间融合表达水平的变异性。相比之下，研究人员采用了多种敏感方法，对每个病例进行单独分析，从而能够准确识别出无融合、低水平融合和高水平融合的样本。研究人员强调，由于DNAJB1::PRKACA蛋白是导致FLC及融合阳性HBL病理改变的主要驱动因素，仅检测DNA或RNA是不够的，必须评估融合蛋白本身。研究结论指出，DNAJB1::PRKACA融合激酶在非FLC癌症中发生并促进其发展。鉴于越来越多的报道描述了该融合在非FLC癌症中的表达，在将其视为FLC标志物时应保持谨慎。对于未来的小儿肝癌研究，对每位患者实施融合免疫检测、融合RT-PCR分析以及RT-PCR-Sanger测序，能够准确识别HBL和BA病例中的融合转录本和蛋白。