走向无动物光毒性测试：一种基于角质形成细胞的UVA筛选方法以区分光刺激与光过敏

《Toxics》：Toward Animal-Free Phototoxicity Testing: A Keratinocyte-Based UVA Screening Assay to Distinguish Photoirritation from Photoallergy

　　

光毒性由于消费品（包括家用产品、药品和化妆品配方）中光反应性化学物质的存在而日益受到关注。在暴露于太阳辐射后，这些化合物可能诱导光刺激（photoirritation，一种非免疫介导的炎症反应）或光过敏（photoallergy，一种免疫介导的超敏反应）。然而，区分光刺激和光过敏反应的能力仍然是一个未满足的需求，因为目前尚无经过验证的体外方法（in vitro assay）可用于此目的。因此，开发可靠的非动物方法对于解决伦理问题并遵守当前对动物测试的监管限制至关重要。白细胞介素-18（Interleukin-18, IL-18）已被提议作为过敏和光过敏反应的潜在生物标志物。在这项研究中，研究人员使用参考光毒性化合物，开发了一种改编自OECD测试指南432（OECD Test Guideline 432）的体外方法，并证明暴露于光过敏原化合物二苯甲酮（benzophenone）可诱导IL-18产生。此外，多重细胞因子谱分析（multiplex cytokine profiling）确定了另外两个初步候选生物标志物，用于区分光过敏和光刺激反应。基质金属蛋白酶-1（Matrix metalloproteinase-1, MMP-1）与光过敏反应相关，并在暴露于氯丙嗪（chlorpromazine）和二苯甲酮后上调，而白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）与光刺激反应相关，并在暴露于8-甲氧基补骨脂素（8-methoxypsoralen）后上调。总体而言，这些发现提供了概念验证（proof-of-concept）证据，支持未来开发一种新型非动物策略，用于预测和区分光刺激和光过敏原化合物。

**论文解读：基于角质形成细胞的UVA筛选方法区分光刺激与光过敏的研究**

**一、研究背景与问题**

光毒性（phototoxicity）是消费品中光反应性化学物质引发的皮肤不良反应，主要包括光刺激（photoirritation，非免疫介导的炎症反应）和光过敏（photoallergy，免疫介导的超敏反应）。当前，OECD测试指南432（OECD TG 432）的体外3T3中性红摄取（NRU）光毒性试验及活性氧（ROS）试验虽能预测化学物质的光毒性潜力，但无法区分光刺激与光过敏。由于动物测试在化妆品领域的禁令及伦理要求，开发可靠的非动物方法成为迫切需求。白细胞介素-18（IL-18）已被证实可作为接触性过敏原的潜在生物标志物，但其在光过敏反应中的作用尚待阐明。因此，本研究旨在开发一种基于人角质形成细胞（HaCaT）的体外模型，通过识别与光过敏早期关键事件相关的候选生物标志物，建立区分光刺激与光过敏的新型非动物测试策略。

**二、研究内容与意义**

研究人员采用HaCaT细胞系替代Balb/c 3T3细胞，改编OECD TG 432方案，以氯丙嗪（CPZ）、十二烷基硫酸钠（SLS）、二苯甲酮（BZ）、8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）和对苯二胺（PPD）等参考化合物进行验证。通过测定细胞活力、细胞内IL-18水平及分泌性细胞因子/基质金属蛋白酶（MMP）谱，发现BZ（光过敏原）可显著诱导IL-18产生，而8-MOP（光刺激物）则无此效应；CPZ（兼具光刺激与光过敏特性）表现出中间行为。此外，MMP-1在光过敏原暴露后上调，IL-6在光刺激物暴露后上调。这些发现为发展无动物测试策略提供了概念验证证据，论文发表在《Toxics》。

**三、主要关键技术方法**

1. **细胞模型**：采用人角质形成细胞系HaCaT（来源：Eucellbank, Celltec UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain），替代OECD TG 432推荐的Balb/c 3T3细胞。
2. **UVA照射条件**：使用UVA灯（峰值发射~365 nm），剂量为4 J/cm²（照射时间28–32 min），通过校准辐射计测量辐照度，确保细胞活力≥80%。
3. **细胞活力测定**：平行采用中性红摄取（NRU）试验和MTT试验，计算半数抑制浓度（IC₅₀）、光刺激因子（PIF）和平均光效应（MPE）以评估光毒性。
4. **IL-18检测**：通过ELISA试剂盒（Elabscience Biotechnology Inc.）定量细胞内IL-18，并以Bradford法测定总蛋白含量进行归一化，计算总刺激指数（TSI）。
5. **细胞因子与MMP谱分析**：使用Human Inflammation Antibody Array C3和Human Matrix Metalloproteinase Antibody Array C1（RayBiotech）半定量检测40种炎症细胞因子和MMPs，通过化学发光成像和密度分析确定候选生物标志物。

**四、研究结果**

**3.1 UVA剂量的确定**
通过比较5 J/cm²和4 J/cm² UVA照射下HaCaT细胞的活力，采用NRU和MTT两种方法检测。结果显示，4 J/cm²条件下未照射和照射的对照细胞活力均≥80%，且标准误差较小，故后续实验采用4 J/cm²。CPZ（光毒性阳性对照）与UVA共暴露导致细胞活力显著下降至<30%，而SLS（非光毒性对照）在光照和黑暗条件下细胞毒性相似，证实了该方法的可靠性。

**3.2 选定化学物质的光毒性谱**
对BZ、8-MOP和PPD进行细胞活力测定。BZ和8-MOP在光照下显示光毒性，IC₅₀值降低，PIF≥5且MPE≥0.15；PPD在浓度≥60 μg/mL时因氧化干扰需谨慎解读，但整体光毒性分类正确。通过进一步低浓度实验确定8-MOP的最大安全浓度为0.02 μg/mL（细胞活力≥75–80%）。

**3.3 IL-18的产生**
细胞内IL-18水平以ELISA定量并归一化。CPZ在光照下对IL-18无显著影响，TSI在0.5 μg/mL时为0.7±0.1，呈轻微下降。BZ在1.25和2.5 μg/mL光照条件下显著增加IL-18（p<0.005），TSI为1.9–2.1，表明其光过敏原特性。8-MOP在光照下未引起IL-18显著变化，TSI接近1，符合其光刺激物分类。PPD在10和20 μg/mL光照下IL-18无统计学显著增加，但暗条件下IL-18较低导致TSI较高（2.9和2.2），实际并非光照诱导。细胞上清液中分泌型IL-18无显著差异，故选择细胞内IL-18作为主要终点。

**3.4 分泌性炎症细胞因子和MMPs的检测**
通过膜基抗体阵列进行探索性筛选，在光照条件下，CPZ和BZ上调MMP-1、MMP-10、TIMP-1和TIMP-2，同时下调IL-6和MCP-1；8-MOP则呈现相反模式（上调IL-6，下调MMP-1）。PPD在光照下几乎下调所有检测的介质，仅MCP-1略有增加。基于信号强度，MMP-1和IL-6被选为最有前景的候选生物标志物，分别与光过敏和光刺激反应相关。

**五、讨论与结论**

**讨论总结**：本研究证实使用HaCaT细胞替代Balb/c 3T3可有效区分光毒性与非光毒性物质，且该模型具有更高的人体相关性。细胞内IL-18在BZ刺激下显著升高，但在CPZ和8-MOP中表现不一，提示IL-18单独使用可能不足以完全区分光过敏与光刺激，需结合其他生物标志物。MMP-1在光过敏原（CPZ、BZ）暴露后上调，而IL-6在光刺激物（8-MOP）暴露后上调，这为建立多标志物组合提供了初步证据。然而，这些发现基于有限数量的参考化合物，需进一步验证。讨论还指出，UVA诱导的ROS可能通过透明质酸降解促进IL-18产生，而IL-6的差异表达可能与光刺激的炎症过程相关。研究强调了实验设计（细胞类型、照射条件、剂量等）对结果的影响，建议结合蛋白质反应性测定和下游细胞生物标志物，以完善不良结果通路（AOP）框架下的光过敏评估策略。

**结论部分翻译**：本研究证明，所提出的模型能够区分光毒性和非光毒性化学物质。除了其预测能力外，该模型还提供了几个潜在优势，包括改善人体相关性以及评估机制相关生物标志物的可能性，这些生物标志物在与其他方法整合时可能有助于区分光刺激和光过敏反应。此外，该检测方法适用于高通量筛选，能够高效评估大量化学物质库，这与当前欧洲监管倡议积极推动整合测试与评估策略中开发并实施新方法学（NAMs）的方向一致。尽管有这些令人鼓舞的发现，但在考虑将其用于监管实施之前，仍需进一步研究。正在进行的工作专注于评估更大、更多样化的化学物质面板，涵盖广泛的光毒性谱，同时通过ELISA方法评估所提出的新型生物标志物（IL-6和MMP-1）。这些研究的结果对于建立该模型的稳健性、可重复性和附加值至关重要，最终巩固其作为整合测试策略中可靠工具的潜力。如果这些额外研究证实其预测性能和机制相关性，该模型在验证后可被纳入分层式下一代风险评估（NGRA）策略。在此类框架中，初始UV/Vis评估后可进行所提出的模型测试，阳性或不确定结果随后通过基于重建人表皮（RhE）的检测进行确认。这种整合的分层方法有望增强光安全性评估的人体相关性和效率，同时积极支持向非动物测试策略的过渡。