死后软骨能否可靠保存乙醇？与血液和尿液的时序比较

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微电极阵列（Microelectrode Array, MEA）技术广泛应用于电生理学研究，近年来在神经毒性筛查中逐渐得到应用。本研究通过MEA分析不同浓度Ni²⁺对大鼠脑片新皮层区域自发放电的平均发放率和平均爆发率，以及电刺激诱发活动频率的影响，从而探讨其神经毒性效应。结合研究团队前期关于Ni²⁺对诱发活动电刺激阈值影响的发现，研究人员比较了四种基于MEA的神经毒性筛查方法在Ni²⁺神经毒性研究中的应用效果。结果表明，所有这些方法均能有效评估Ni²⁺的神经毒性效应；然而，它们在适用的神经元网络和数据处理方法等方面存在差异。研究人员还发现，Ni²⁺通过不同的机制影响大鼠脑片新皮层区域的自发放电和电刺激诱发活动。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
神经毒性是指化学物质对神经系统结构或功能的不良影响，核心关注与神经元及神经元网络电兴奋性直接相关的功能改变。传统的体外细胞毒性检测方法仅能评估细胞增殖、形态结构变化及特定分子标志物，无法捕捉神经元和神经元网络的电兴奋性变化，因此不能全面反映化学物质诱导的神经毒性效应。目前，大多数神经毒性效应只能通过耗时且资源密集的体内动物实验来识别。因此，建立一种能够实时监测神经元网络电兴奋性变化、并与传统体外细胞毒性检测相结合的可靠体外检测方法，对于药物开发早期评估化学物质的神经毒性至关重要。微电极阵列（Microelectrode Array, MEA）技术可实时检测由多个神经元组成的神经元网络的电生理活动，克服了传统单细胞电生理检测方法（如膜片钳技术）只能记录单个神经元的局限。近年来，多家公司开发了集成MEA的多孔板平台，兼具多通道记录能力与高通量筛查潜力，可用于大规模药物神经毒性筛查。MEA记录的主要信号是细胞外电位，通过分析活动的时空特征可获取动作电位发放率（spike发放率）和爆发率（bursting rate）等基本指标。目前基于MEA的神经毒性评估方法主要分为两类：监测自发放电变化和评估诱发活动变化。在自发放电分析中，平均发放率和平均爆发率是最基本的方法。在电刺激诱发活动检测中，通常分析刺激后短时间窗（通常<100 ms）内的活动频率，但由于爆发数有限，爆发率较少被分析，而常用的是评估电刺激诱发spike的频率特征。然而，数据处理复杂限制了其大规模应用。为此，研究团队前期开发了一种新方法，通过分析诱发活动所需电刺激阈值的变化来评估化学物质对神经元网络兴奋性的影响，简化了数据处理流程，更适合高通量筛查。Ni²⁺是电压门控Ca²⁺通道和NMDA受体的常见抑制剂，可抑制神经元兴奋性并产生神经毒性。本研究利用MEA技术研究不同浓度Ni²⁺对大鼠脑片新皮层自发放电平均发放率、平均爆发率以及电刺激诱发活动频率的影响，并结合前期关于Ni²⁺对同一脑区诱发活动电刺激阈值的研究，比较四种神经毒性评估方法对Ni²⁺神经毒性的检测效果。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：①急性脑片制备：从14日龄SPF级Sprague-Dawley大鼠（雌雄混合，体重20-35 g，来自上海实验动物研究中心）中获取300 μm厚冠状脑片，置于MEA记录系统中；②自发放电记录与分析：使用MEA2100系统（MCS, Reutlingen, Germany）记录45 min自发放电，随后换用含不同浓度（0, 50, 100, 200, 500 μM）NiCl₂的人工脑脊液（ACSF）孵育20 min，再次记录45 min，利用wave_clus（v3.03）MATLAB工具包识别spike，并采用MaxInterval法识别爆发；③电刺激诱发活动记录与频率分析：从电极阵列中心附近选取一个能记录自发放电的电极作为刺激电极，施加900 mV强度、60次连续单脉冲刺激，记录刺激后50 ms内的spike密度变化，通过高斯核密度估计（核宽=3 ms）计算刺激后发放率（PSFR）曲线，比较第一峰振幅和峰时；④电刺激阈值检测方法（源自前期研究）：采用递增刺激强度（100-1000 mV）确定每个电极稳定诱发活动的最低电压，比较Ni²⁺暴露前后的阈值变化。数据统计使用Shapiro-Wilk检验正态性，非参数检验采用Kruskal-Wallis检验和Conover-Iman事后检验，多重比较用Holm校正，p<0.05为显著性。

**研究结果**

**3.1 Ni²⁺对神经元网络自发放电平均发放率和平均爆发率的影响**
通过配对样本Wilcoxon符号秩检验分析，结果显示：与对照组相比，50 μM和100 μM Ni²⁺显著降低了自发放电的平均发放率和平均爆发率，表明网络兴奋性受到明显抑制，这与Ni²⁺抑制电压门控Ca²⁺通道和NMDA受体的作用一致。然而，200 μM和500 μM Ni²⁺处理组与对照组相比，平均发放率和平均爆发率均无统计学显著差异，即抑制效应消失。该结果与研究人员前期研究一致。此外，平均发放率和平均爆发率在不同浓度Ni²⁺暴露前后表现出相同趋势，但两者反映不同的电生理特征（发放率反映spike数量，爆发率反映时间组织模式），其反应并不总是一致。

**3.2 Ni²⁺对神经元网络电刺激诱发活动频率的影响**
通过比较PSFR第一峰振幅和峰时，结果显示：Ni²⁺浓度变化对峰时无显著影响，但第一峰振幅随Ni²⁺浓度升高而逐渐降低。无Ni²⁺实验组和50 μM Ni²⁺组的PSFR第一峰振幅与对照组无显著差异；100 μM、200 μM和500 μM Ni²⁺均显著降低第一峰振幅。进一步分析振幅百分比变化，发现随着Ni²⁺浓度增加，振幅降低幅度呈增大趋势（100 μM、200 μM、500 μM组中位数分别降低8.23%、20.88%、69.08%），表明Ni²⁺对电刺激诱发活动产生浓度依赖性抑制，与前期阈值研究结果一致。

**3.3 Ni²⁺对神经元网络电刺激诱发活动阈值的影响**
参考前期研究结果：暴露于50, 100, 200, 500 μM Ni²⁺后，记录电极的刺激阈值中位数分别增加14.3%、20%、36.7%和72.2%，表明Ni²⁺对神经元网络兴奋性产生浓度依赖性抑制。

**讨论与结论**
讨论部分总结了四种方法对Ni²⁺神经毒性的检测效果：自发放电方法（平均发放率和爆发率）仅在50-100 μM浓度下显示抑制，而200-500 μM时无显著差异，原因可能与高浓度Ni²⁺同时阻断兴奋性和抑制性突触传递有关。通过分析爆发中spike百分比（% spikes in bursts），发现500 μM Ni²⁺显著降低该比例，表明突触传递受损，支持上述机制。诱导活动方法（频率分析和阈值检测）则显示浓度依赖性抑制，因为诱发活动主要反映兴奋性神经元和兴奋性突触的功能。因此，自发放电和诱发活动对Ni²⁺的反应差异源于两者涉及的神经元网络成分不同：自发放电受兴奋性和抑制性神经元共同调节，而诱发活动主要受兴奋性通路影响。四种方法中，电刺激阈值检测方法具有数据稳定性好、无需手动调整刺激强度等优势，但实验时间较长，更适合体外培养网络。研究还指出，高浓度Ni²⁺的细胞毒性效应需注意，且MEA数据无法区分兴奋性和抑制性神经元，机制解释有待进一步实验验证。

**结论翻译**：研究人员利用MEA研究不同浓度Ni²⁺对大鼠脑片新皮层区域三个电生理参数的影响：平均自发放电率、平均自发爆发率以及电刺激诱发活动频率。结合前期关于Ni²⁺对诱发活动刺激阈值的影响，进行了四种MEA电生理方法在Ni²⁺神经毒性筛查中的效果比较分析。此外，探讨了不同浓度Ni²⁺影响自发放电和电刺激诱发神经元网络活动的潜在机制。所有四种方法均对Ni²⁺诱导的神经毒性敏感。值得注意的是，研究人员提出的新型电刺激阈值检测方法在大规模神经毒性筛查中具有显著应用潜力。这项工作为基于MEA的神经毒性筛查技术的实际应用提供了有价值的见解。