利用离心式银等离子体纸基底和表面增强拉曼光谱技术进行的指刺采集全血分析

《Analytica Chimica Acta》：Finger-Prick Whole Blood Analysis via Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Using Centrifugal Silver Plasmonic Paper Substrates

　　

摘要

背景

由于血红蛋白、泛硫胺素和其他基质成分的光谱干扰，直接对全血进行表面增强拉曼散射（SERS）分析仍然具有挑战性，通常需要进行样品预处理。在这里，首次将离心银等离子体纸（CSPP）应用于通过指尖采血收集的未经处理的毛细血管血液，在用于采样的同一纸条上原位生成SERS活性银纳米结构，从而消除了预处理和提取步骤。采用多因素实验设计来区分四种光谱变化来源（储存温度、储存时间、沿纸条的空间位置以及供体间的差异），并通过线性混合模型-主成分分析（LiMM-PCA）框架进行解析。

结果

所有模型效应在统计上均显著（排列检验，p < 0.001）。沿纸条的空间位置是光谱变异的主要来源（57%），超过了供体间差异（12%），而储存时间和温度的贡献较小但可检测到（各低于2%）。SERS光谱主要由泛硫胺素和白蛋白结合的尿酸带主导，沿纸条存在的分析物特异性空间梯度与由离心驱动的纸层析分离机制一致。

意义

这些发现表明，CSPP是一种强大的无试剂平台，可用于直接对未经处理的毛细血管血液中的代谢物进行SERS分析。LiMM-PCA提供的严格方差分解确定了空间位置是影响测量重复性的主要因素，为协议优化提供了定量依据。这种方法对开发即时检测和远程生物监测设备具有直接意义。

引言

血液中含有多种代谢物，这些代谢物可以作为生理和病理状况的重要生物标志物[1]。通过指尖采血收集少量毛细血管血液已成为临床分析和环境生物监测中越来越受欢迎的方法[2, 3]，与传统静脉穿刺相比具有关键的实际优势：该过程侵入性小，不需要专业人员，生成的样品体积仅為微升级，适合现代灵敏仪器的检测，并且便于在家庭或现场环境中自我采集[4]。这些特性使毛细血管血液成为从新生儿筛查和治疗药物监测[5]到评估人体对持久性环境污染物的暴露[6]等广泛应用的首选基质。在此背景下，干血斑（DBS）采样技术最为成熟和多功能，即通过指尖采血后将血液滴直接滴在滤纸上并干燥。DBS卡片在室温下可长时间保持稳定，支持分散采集后进行集中分析，并已成功与多种检测平台结合使用，包括液相色谱-质谱[7]、免疫测定[8]以及最近的振动光谱技术[9, 10]。表面增强拉曼散射（SERS）光谱结合了拉曼指纹的分子特异性和金属纳米结构表面等离子体增强带来的极高灵敏度，因其能够在微量浓度下实现快速、低试剂需求和多污染物检测而成为分析血液衍生物的理想选择[11, 12]。然而，直接对全血进行SERS分析仍面临重大挑战：血液基质的复杂性（包括红细胞、丰富蛋白质、脂质和多种低分子量代谢物）会产生严重光谱干扰。特别是，当使用紫光、蓝光或绿光激光源时，血红蛋白和血红素基团的共振拉曼带会掩盖感兴趣的微量分析物的信号[13, 14, 15, 16, 17, 18]。此外，近年来的研究还表明，血液的SERS信号主要受泛硫胺素主导；这种膳食氨基酸通过其咪唑-2-硫醇基团在等离子体纳米结构上的高度选择性和吸附性，导致之前发布的生物分析数据需要重新解读[19, 20]。因此，基于SERS的全血分析几乎总是需要在光谱采集前进行一个或多个预处理步骤，如蛋白质沉淀、稀释或液-液萃取，这些步骤不仅增加了复杂性，还增加了分析物损失的风险，并削弱了毛细血管采样的便捷性。Suarez等人探索了DBS采样与SERS检测之间的概念桥梁，他们通过简单的水液萃取和转移程序，在银纳米颗粒基底上实现了对干血斑的超灵敏SERS检测[14]。然而，即使在这种方法中，仍需要一个中间液液萃取步骤将分析物从纸基质转移到预先形成的等离子体基底上，这重新引入了操作瓶颈，并使分析受到预制SERS基底（如储存过程中金属纳米结构的渐进性空气氧化和表面降解）的已知限制。

最近，离心银等离子体纸（CSPP）方法作为一种适用于生物流体SERS分析的一体化程序被引入[21]，其性能可与更常用的SERS基底相媲美[22]。CSPP不是将生物流体沉积在现有的等离子体材料上，而是在采集样本的同一纸支撑物上原位生成基于银纳米颗粒的SERS基底。在此，我们扩展了这一概念，利用CSPP方法直接分析指尖采血的毛细血管全血，消除了传统样品预处理和DBS-SERS工作流程中固有的提取步骤。这要求我们对可能影响最终SERS信号变化的因素进行严格表征。因此，我们通过受控实验设计系统地研究了三个主要变异来源：（i）血液加载纸条在沉积银纳米颗粒之前的储存条件，特别是保存时间和温度；（ii）沿CSPP的毫米级空间位置，这是由于血液成分和银纳米颗粒在离心后的不均匀分布所致；（iii）不同供体间的生物学差异，反映了实际毛细血管血液样本的固有生化异质性。鉴于SERS数据的多变量和内在复杂性，分离这些同时存在的变异来源需要超越单变量统计方法的分析工具。为此，我们采用了线性混合模型-主成分分析（LiMM-PCA）框架[23]，这是一种基于ASCA技术的多变量方法[24]，它将数据集的总光谱方差分解为可归因于每个实验因素及其相互作用的贡献，从而能够处理不平衡的设计和随机效应，提供了驱动信号变异的因素解析和光谱可解释的图像。综上所述，CSPP在经典DBS-SERS策略和传统依赖于预处理的全血分析方法之外，为快速、稳健且操作简单的毛细血管血液SERS分析开辟了新途径，适用于临床和环境生物监测应用。

部分摘录

材料和试剂

超纯去离子水（18.2 MΩ·cm at 25°C）来自Milli-Q纯化系统（Millipore，Merck，德国达姆施塔特）。硫酸（H₂SO₄）和硝酸（HNO₃）用于玻璃器皿清洗。

银纳米颗粒（AgNPs）的合成与表征

合成前，所有玻璃器皿均用Nochromix硫酸（Godax Laboratories，美国马里兰州贝塞斯达）和硝酸清洗，以去除金属残留物，特别是银。最后用Milli-Q水冲洗。银纳米颗粒（AgNPs）的合成过程如下：

使用CSPP对血液进行SERS分析（初步空间表征）

进行了初步实验，以确定室温下时间零点时SERS光谱沿样本轴的空间变化，为主要实验设计选择测量位置提供依据（图3）。CSPP形成后，直接从纸条上观察到了强烈的光谱信号，无需任何进一步的样品预处理。在482、639、727、750、1004、1125、1224、1319、1362、1449、1580和1660 cm^?1处观察到了明显的振动跃迁。

结论

本研究探讨了基于纸张的采样和SERS基底设备（CSPP）用于分析外周全血样本的适用性，结合了经过验证的多因素实验设计和LiMM-PCA模型来表征SERS信号的空间和存储相关行为，并将观察到的光谱模式与特定血液代谢物联系起来。该方法从未经处理的血液中获得了SERS光谱，显示了尿酸等可识别的特征带。

CRediT作者贡献声明

Alois Bonifacio：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源准备，项目管理，概念构思。Stefano Fornasaro：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，数据分析，概念构思。Cicero Cena：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。Camila Calvani：撰写 – 审稿与编辑，调查，数据管理

作者声明没有利益冲突。

在准备本研究的过程中，作者使用了Claude工具来提高内容的可读性和语言表达。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审核和编辑，并对发表文章的内容负全责。

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了马托格罗索州教育、科学和技术发展基金会（FUNDECT-MS，授权号02/2024）的支持，通过FUNDECT/CONFAP的MCI/2023 - CONFAP-Italy Mobility Program项目；CAPES高等教育人员培训协调局，财务代码001；以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq），代码444388/2023-0, 302525/2022-0。开放获取资金由Università degli Studi di提供。

Camila Calvani|Stefano Fornasaro|Cicero Cena|Alois Bonifacio^{巴西马托格罗索联邦大学（UFMS），Av. Costa e Silva s/n, 79070-900, Campo Grande-MS}