激发-发射矩阵荧光光谱监测咖啡发酵：绿原酸对发射带的贡献及发酵阶段的区分

《Applied Food Research》：Excitation–emission matrix fluorescence spectroscopy for monitoring coffee fermentation: contribution of chlorogenic acid to the emission band and discrimination of the fermentation stage

　　

摘要 绿原酸（CGA）被广泛提议作为咖啡发酵的荧光指示剂，但咖啡提取物的荧光是否反映其CGA含量尚未得到验证。研究人员采集了印度尼西亚罗布斯塔咖啡豆在发酵0-4天后水提取物和磨碎粉末的激发-发射矩阵（EEMs），并通过高效液相色谱（HPLC）测定CGA。CGA标准品在激发波长约370 nm和发射波长约450 nm处发出荧光。在标准添加实验中，添加标准品的振幅（自由拟合）与体积已知的量相匹配（α/f?=?0.8–1.1），因此CGA在提取物中具有加和性和大致定量性。然而，它仅提供该发射带的三分之一到三分之二，其强度并不随CGA含量增加而增加，因此该发射带并非CGA的读出值。对于单个提取物，参考值也定义不佳：同一批次内的咖啡豆在CGA含量上的差异大于发酵阶段之间的差异，仅有33%的变异存在于阶段之间。因此，研究人员不声称可以从EEM定量测定CGA。相比之下，线性判别分析（LDA）对未见过的咖啡豆提取物的发酵阶段进行区分，水提取物准确率为71%，粉末为57%（随机概率20%），仅对1-4天阶段则为73%，且未发酵豆无错误。由于只采样了一次发酵批次，这些准确率界定了独立批次预期表现的边界。因此，水提取物的EEM是发酵阶段的一个有前景的指示指标，而CGA定量则需要针对每个提取物测量参考值。

论文解读：激发-发射矩阵荧光光谱用于监测咖啡发酵：绿原酸对发射带的贡献及发酵阶段的区分

**研究背景与存在问题**

咖啡是全球消费最广泛的饮料之一，特种咖啡（Specialty Coffee）因其卓越品质备受市场青睐，其中发酵处理是提升罗布斯塔咖啡品质的关键工艺。然而，传统发酵控制依赖生产者的经验与感官判断，受到专家数量减少及主观评判波动的影响，导致生产过程不稳定。为克服这一局限，引入数字化监控系统成为提升效率与品质的重要途径。荧光光谱技术因具有快速、非破坏性及高灵敏度等优点，被广泛用于食品质量监测，其中绿原酸（chlorogenic acid, CGA）因其强荧光特性被认为是咖啡发酵的潜在指示剂。然而，CGA的荧光发射带与咖啡中其他酚类化合物重叠，其实际贡献尚未得到验证。因此，本研究旨在评估基于荧光光谱的监测方法能否准确报告罗布斯塔咖啡发酵过程中的信息，并明确CGA在发射带中的具体作用。

**研究目的与意义**

研究人员聚焦于以下问题：CGA是否真的是咖啡提取物荧光的主要来源？是否能从激发-发射矩阵（excitation-emission matrix, EEM）中定量预测CGA含量？以及EEM能否有效区分不同发酵阶段？该研究发表在《Applied Food Research》上，其成果为开发基于荧光的在线发酵监控系统提供了理论基础，有助于推动咖啡生产的数字化与标准化。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：1）通过高效液相色谱（HPLC）测定发酵咖啡豆中5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA，即CGA的主要异构体）的含量，每个发酵阶段取3个独立豆子进行测定，以评估豆间变异。2）利用荧光分光光度计（FP-8300）采集水提取物和磨碎粉末的EEM光谱，水提取物采用直角法测量，粉末采用前表面法测量。3）通过标准添加实验，将已知浓度的CGA标准溶液加入水提取物中，利用最小二乘拟合评估CGA荧光的加和性。4）采用主成分分析（PCA）结合线性判别分析（LDA）对发酵阶段进行分类，并利用偏最小二乘回归（PLS-R）尝试预测CGA浓度，采用留一批交叉验证（leave-one-batch-out）避免数据泄露。样本来源于印度尼西亚楠榜省2023年收获的罗布斯塔咖啡豆，经有机发酵0-4天，采用水洗法处理。

**研究结果**

**3.1 杯测与化学分析**：通过杯测（Cup Test）评估发现，发酵1-2天后整体偏好评分最高（2天均值77.4分），3-4天下降，感官最佳值出现在2-3天宽峰区间。HPLC测定显示，CGA平均浓度在0-2天从0.234 mg/mL降至0.150 mg/mL，随后2-4天回升至0.182 mg/mL。但每个阶段的三次测定值离散度大（变异系数高达27%），单因素方差分析显示阶段间差异不显著（F=2.49, p=0.11），方差分解表明仅有33%的CGA变异归因于发酵阶段，其余67%为豆间变异。因此，CGA含量作为发酵进程的标记具有局限性。

**3.2 CGA标准品的荧光及其对提取物发射带的贡献**：CGA标准溶液在激发波长约370 nm、发射波长约450 nm处出现荧光峰。标准添加实验表明，在咖啡提取物基质中，添加的CGA标准品荧光具有加和性并与体积分数基本一致（α/f=0.8-1.1），证明CGA荧光在提取物中可被直接观测。然而，根据标准品比荧光强度与HPLC含量估算，CGA仅贡献了460 nm发射带的35-65%（约三分之一到三分之二），且发射带强度（460 nm）不随CGA含量增加而增加（水提取物与粉末的Pearson相关系数分别为-0.82和-0.87），因此该发射带不能作为CGA含量的读出值。

**3.3 CGA浓度的预测及验证设计的影响**：基于随机分割的PLS-R模型看似准确（水提取物R2=0.82，RMSEP=0.012 mg/mL），但采用留一批交叉验证后模型失效（水提取物R2=-0.87，RMSEP=0.038 mg/mL；粉末R2=-0.47，RMSEP=0.034 mg/mL），预测值趋近于全局均值，且RPD小于1。这是因为每个发酵阶段仅有一个批次均值作为参考，而豆间变异使得参考值无法代表单个提取物的真实CGA含量。因此，研究人员不声称能从EEM定量预测CGA。

**3.4 发酵阶段区分：水提取物与粉末的比较**：利用激发波长370 nm的发射光谱，通过PCA-LDA进行分类。水提取物在分层五折交叉验证中达到71%准确率（随机概率20%），粉末为57%；仅考虑1-4天阶段时，水提取物准确率73%，粉末44%；未发酵豆（0天）在两种样品形式中均无错误区分。当训练集与测试集按时间分离时，水提取物模型准确率基本不变（72%），粉末下降5个百分点，表明结果并非源于短期仪器漂移。由于仅一次发酵批次，这些准确率应视为独立批次表现的上界。粉末样品中，叶绿素在680 nm附近的强荧光干扰了CGA信号的检测，导致区分效果较差。

**讨论与结论**

研究人员总结指出，EEM荧光光谱无法定量预测CGA浓度，但能够有效区分发酵阶段，尤其水提取物形式优于粉末。未发酵豆的零错误识别具有直接实用价值，可用于在线检测未发酵批次污染。然而，本研究存在关键局限：仅采样了一个发酵批次，各阶段间存在伪重复，且发酵时长与处理时间混杂。因此，需要多批次独立发酵实验来验证区分信息的可转移性。此外，CGA定量需针对每个光谱测量提取物单独测定其参考值，且需扩大浓度范围。

**研究结论翻译**：本研究考察了EEM荧光光谱能否追踪罗布斯塔咖啡的发酵过程，以及CGA在测量信号中的角色。CGA标准品在激发和发射波长接近370 nm和450 nm处发出荧光，标准添加实验表明该荧光在咖啡提取物中具有加和性和大致定量性（α/f=0.8-1.1）。因此，CGA在提取物的EEM中可直接观测。然而，它仅贡献了发射带的大约三分之一到三分之二，且发射带强度不随CGA含量跨阶段增加；因此，在随机分割下看似准确的PLS-R模型在留一批交叉验证时无法预测CGA浓度（R2=-0.87）。EEM实际提供的是发酵阶段（严格来说是发酵时长及伴随的干燥和处理）的区分能力：水提取物准确率71%，粉末57%（随机概率20%），仅1-4天阶段为73%，且未发酵豆无错误识别。其中，未发酵豆的错误识别为零，这直接有用，可作为在线检测未发酵批次污染的要求，而1-4天阶段仅能分辨到天级。由于仅采样了一个发酵批次，且区分是分类而非时间单调的，这些准确率界定了独立批次预期表现的上界。水提取优于粉末前表面测量，因为粉末中叶绿素在680 nm附近的发射干扰并再吸收酚类发射。分析验证需要提取，因此研究人员设想的实际路线不是对豆子的非接触测量，而是液体测量：发酵罐在整个过程中含有液体，取出少量液体可在现场跟踪批次发酵而不中断。本比较支持液体形式优于粉末形式，但未测试该路线。本工作测量的提取物是在实验室中从清洗和干燥的豆子中制备的；罐内液体是不同基质，含有粘液、糖、有机酸和活微生物群落，研究人员未测量它。记录罐内液体本身的EEM，并测试发酵阶段是否仍可在该基质中区分，是本工作指出的下一步。本工作的主要局限性是仅采样了一个发酵批次，因此没有批次级别的重复。CGA参考值仅定义了五个浓度水平，区分结果虽然通过不同豆子制备的提取物获得，并在训练和测试光谱按时间分离时得到确认，但仍需在独立批次上验证。建立定量CGA校准需要针对光谱测量的同一提取物测定CGA含量，并覆盖更宽浓度范围。在当前材料中，同一批次内单个豆子的CGA含量变异大于发酵阶段之间的变异——发酵阶段仅占总方差约三分之一——因此以批次均值定义的参考值无法描述单个提取物。这种异质性本身也具有实际意义，因为它设定了发酵批次CGA含量可控性的极限。此外，这也是优先选择发酵阶段而非CGA含量作为监测目标的原因：在大多数情况下，EEM能够区分来自未见豆子的提取物所属阶段，而该提取物的CGA含量甚至无法通过批次级参考值精确定义。在这些局限内，EEM荧光结合水提取为特种咖啡工业提供了发酵进程的快速指示指标，并具有应用于其他农产品的潜力。