N-酰基甘氨酸的合成及其作为食品共乳化剂的应用

《Applied Food Research》：Synthesis of N-acyl glycine and its application as a food co-emulsifier

　　

N-酰基氨基酸（NAA）是通过氨基酸与脂肪酸之间的酰胺键形成的两亲性脂氨基酸。NAA可通过Schotten–Baumann反应合成；然而，该过程存在若干局限性，例如过度使用有害物质。因此，在本研究中，研究人员旨在开发一种通过热诱导蒸发条件下的酯-酰胺交换来合成NAA的替代方法。使用单酰基甘油（MAGs；甘油单棕榈酸酯、甘油单油酸酯和甘油单月桂酸酯）作为酰基供体，甘氨酸作为酰基受体，以制备N-酰基甘氨酸（NAG）。每种MAG通过超声处理与甘氨酸溶液（pH 9.8）水合，所得产物经干燥并通过液-液萃取纯化。NAG的合成通过LC–ESI–MS/MS和MALDI–TOF MS确认。结构表征使用¹H和¹³C NMR以及FTIR进行。此外，在5% O/W乳液中研究了NAG的乳化能力，该乳液由PC/NAG（9:1，w/w）乳化剂混合物（0.5%）制备，产生了具有低多分散指数的均匀纳米级液滴。进一步，为模拟酱状食品体系，制备了由PC/N-油酰甘氨酸（1:1，w/w）乳化剂混合物（1%）稳定的20% O/W乳液，并评估了其10天的储存和氧化稳定性。尽管观察到一些统计学显著差异，但储存期间液滴尺寸、zeta电位和过氧化值的总体变化相对较小。这些结果表明，NAG可与磷脂酰胆碱作为有效共乳化剂，并可能在食品相关乳液中具有潜在应用。

**研究背景与问题**
N-酰基氨基酸（NAA）是一类通过氨基酸与脂肪酸之间酰胺键形成的两亲性脂氨基酸，具有潜在的原细胞膜前体功能，并在生命起源研究中备受关注。传统上，NAA通过Schotten–Baumann反应合成，但该方法依赖大量有害物质，且对高熔点酰基供体（如甘油单棕榈酸酯GMP）的适用性受限。此外，现有替代方法（如基于干脂膜的湿-干循环法）在处理高熔点底物时存在困难。因此，研究人员旨在开发一种更绿色、高效的合成策略，利用热诱导蒸发条件下的酯-酰胺交换反应，以单酰基甘油（MAGs）为酰基供体、甘氨酸为酰基受体，合成N-酰基甘氨酸（NAG），并评估其作为食品共乳化剂的潜力。该研究发表于《Applied Food Research》。

**主要技术方法**
研究人员采用热诱导蒸发法，将甘氨酸（pH 9.8）与MAGs（GMP、甘油单油酸酯GMO、甘油单月桂酸酯GML）通过超声分散后，在90–100°C下干燥36小时，再密封反应64小时，以酯-酰胺交换合成NAG。纯化时使用绿色溶剂（乙酸乙酯和水）进行液-液萃取，结合pH调节和正己烷洗涤。结构表征通过¹H和¹³C核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认；分子量鉴定借助液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。乳液性能评估采用动态光散射（DLS）测量粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位，并通过过氧化值（PV）测定氧化稳定性。

**研究结果**
**3.1. 通过Schotten–Baumann反应合成与纯化N-酰基甘氨酸**
通过传统化学方法合成了NPG、NOG和NLG，纯化后产率分别为54.3%、60.1%和42.0%。该反应在碱性条件下进行，产物需经酸化后用有机溶剂萃取。

**3.2. 碱性热诱导蒸发条件下N-酰基甘氨酸形成的反应机制**
研究人员提出了酯-酰胺交换的机制：甘氨酸的游离胺基（-NH₂）在pH>9.6时亲核进攻MAG的酯键，形成酰胺键并释放甘油。同时，皂化反应（水解）和甘氨酸自缩合（形成肽键）作为竞争反应存在。通过控制水分活度（0.589至0.206）平衡反应方向。

**3.3. 酯-酰胺交换合成N-酰基甘氨酸的纯化**
利用NAG（pKa≈3.7）与脂肪酸（pKa≈7）的酸度差异，通过pH 8时萃取去除脂肪酸，pH 3时萃取回收NAG，再用正己烷洗涤去除残留脂肪酸和MAG。最终产率：NPG 17.4%、NOG 8.4%、NLG 24.0%。产率降低归因于不完全转化、皂化竞争、甘氨酸自缩合及纯化损失。

**3.4. 通过¹H和¹³C NMR波谱表征N-酰基甘氨酸结构**
¹H NMR显示酰胺峰（8.08 ppm）确认NPG合成；NOG在5.34–5.31 ppm出现双键峰。`<sup>13</sup>C NMR`中酰胺峰（171.90 ppm）及NOG的双键峰（130.10 ppm）进一步验证结构。

**3.5. N-酰基甘氨酸的FTIR分析**
FTIR谱图显示NAG的酰胺N–H伸缩（3325.83 cm^-1）、C=O伸缩（酰胺带I，1642.28 cm^-1）和C–N弯曲（酰胺带II，1554.61 cm^-1），证实了酯-酰胺交换的完成。

**3.6. N-酰基甘氨酸的质谱分析（MALDI-TOF-MS和LC–ESI–MS/MS）**
MALDI-TOF-MS检测到NAG的加合离子峰（如[M+H]⁺、[M+Na]⁺），并发现酰化二甘氨酸（Di）等副产物。LC-ESI-MS/MS确认了碎片离子（如甘氨酸离子m/z 74.10），且副产物在化学合成中也有痕量存在。

**3.7. N-酰基甘氨酸的热学和形态学表征**
差示扫描量热法（DSC）测得熔点：NPG 124–125°C，NOG 83–89°C，NLG 118–120°C，表明链长和饱和度影响熔点。扫描电子显微镜（SEM）显示热干燥样品呈棒状纤维形态，纯化后NPG呈现花状聚集体形态。

**3.8. 由PC和N-酰基甘氨酸共稳定乳液的胶体与氧化稳定性**
在5% O/W乳液（PC/NAG=9:1，0.5%乳化剂）中，所有NAG均产生约200 nm的均匀液滴，PDI为0.21–0.25。zeta电位显示PC/NPG（-36.60 mV）和PC/NOG（-39.73 mV）比PC单独（-25.07 mV）更负，增强了静电排斥。在20% O/W乳液（PC/NAG=1:1，1%乳化剂）中，NAG单独无法稳定乳液，但作为共乳化剂时，PC/NOG乳液在10天储存期间（4°C和24°C）液滴尺寸和zeta电位变化较小，过氧化值在4°C下较低（8.7–9.6 meq/kg），但24°C下氧化加速（14.7–17.9 meq/kg）。结果表明NAG可作为PC的有效共乳化剂，但需在冷藏条件下使用，并可能需添加抗氧化剂。

**讨论与结论**
讨论部分指出，热诱导蒸发法虽反应时间较长、能耗较高，但可模拟原始地球湿-干循环条件，为理解两亲分子形成提供新视角。乳液研究表明，NAG作为共乳化剂能改善PC乳液的负电荷和稳定性，尤其NOG效果显著。但NPG因高熔点水合困难，需考虑钠盐形式。结论部分翻译：在本研究中，研究人员通过热诱导蒸发下的酯-酰胺交换合成了多种NAG，而非Schotten–Baumann反应。为此，利用原始地球湿-干循环的热干条件作为缩合反应的驱动力。甘氨酸用作酰基受体，MAG衍生物GMP、GMO和GML用作酰基供体来合成NAG。所提出的合成方法对高熔点MAG（如GMP）也适用。纯化过程中使用绿色溶剂进行液-液萃取，随后用正己烷洗涤获得高纯度产品，并对NAG的结构、熔融性质和晶体形态进行了表征。当比较通过化学Schotten–Baumann反应和简单热诱导蒸发条件下的酯-酰胺交换反应合成NAG时，后者需要更长的反应时间和更高的能量投入相对于最终产率。然而，本研究的目的不仅仅是评估合成效率，而是为了深入了解在原始地球条件下，具有不同理化性质的氨基酸和脂肪酸如何形成两亲性分子。此外，乳液研究的结果证明了NAG作为功能性、可生物降解的共乳化剂与PC一起使用的可行性，并提示其在食品工业中的实际应用潜力。