Geneformer引导的多组学整合鉴定Pbx1为造血干细胞衰老的网络枢纽

《SCIENCE ADVANCES》：Geneformer-guided multiomics integration identifies Pbx1 as a network hub of hematopoietic stem cell aging

　　

摘要
造血干细胞（HSCs）构成一个有组织的造血系统，该系统会经历与年龄相关的改变，包括血小板生成增加和红细胞生成减少。驱动这些转变的基本机制仍不完全清楚。研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据表明，衰老HSCs包含两种不同的转录程序：一种与巨核细胞共享，另一种反映最原始的HSC状态。发育时间序列分析进一步提示，这些程序的获得始于生命早期，其中原始模块在出生前上升，而巨核细胞引发在出生后出现。通过使用微调后的Geneformer（基于Transformer的深度学习模型）来捕捉年轻与衰老HSCs之间的高阶差异，结合转录组和表观遗传组分析以及转录因子筛选，研究人员鉴定出Pbx1是这些与年龄相关的转录和分化变化的关键调节因子。具体而言，Pbx1通过抑制Gata1表达来抑制红系分化。这些发现为HSC衰老提供了见解，并可能为调节与年龄相关的HSC功能障碍提供方法。

论文解读文章

**研究背景与问题**
干细胞生理性衰老是决定个体一生中组织稳态和功能维持能力的关键因素。尽管多种因素与干细胞衰老相关，但内在转录和表观遗传因子网络在干细胞衰老过程中如何被重塑仍不清楚。造血干细胞（HSCs）及其后代构成一个明确的干细胞系统，通过自我更新和产生多能祖细胞（MPPs）及定向祖细胞来维持终身造血。与其他干细胞类型类似，HSCs的功能能力和表型特征随年龄增长而逐渐改变：它们表现出向血小板和髓系细胞分化的倾向增加，向红细胞和淋巴细胞分化的能力下降，自我更新能力增强且数量扩增，同时伴随对血液系统疾病的易感性增加。HSC衰老的诱导是一个多因素过程，受外部环境信号和内部细胞变化的相互作用影响。开创性的单细胞谱系追踪和条形码研究已证明，在年轻小鼠的免疫表型HSCs中即可检测到向巨核细胞的转录启动。这些发现提示谱系偏向在早期就已编码，并提出了一个关键问题：这种预先存在的结构如何随年龄增长而被重塑。尽管表观遗传漂变、复制应激、慢性炎症和改变的细胞因子微环境均被认为与HSC基因调控网络（GRN）在衰老过程中的重塑有关，但这些外部输入如何汇聚于内在转录枢纽仍不清楚。本研究旨在探究是否存在一组离散的“枢纽”因子可以解释衰老HSCs的自我更新优势和谱系偏向。值得注意的是，当衰老HSCs被移植回年轻宿主时并不能恢复年轻状态，这一观察结果提示这种高阶GRN的改变是硬连线的。因此，鉴定控制这一转录网络的枢纽因子对于理解干细胞衰老和探索恢复活力的方法至关重要。

**研究内容与结论**
研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结合微调后的Geneformer（一种基于Transformer的深度学习模型），整合转录组和表观遗传组分析以及转录因子（TF）筛选，鉴定出Pbx1（Pre-B细胞白血病同源盒1）是协调HSC衰老相关转录和分化变化的关键调节因子。研究表明，衰老HSCs同时表达两种不同的转录程序：一种与最原始的HSCs共享（Group 1），另一种与巨核细胞/血小板谱系共享（Group 2）。Pbx1主要调控Group 1基因，并通过抑制Gata1表达来抑制红系分化，从而介导衰老HSCs的血小板偏向。体内实验证实，Pbx1过表达诱导年轻HSCs产生血小板偏向，而Pbx1敲低或药物抑制可部分缓解衰老HSCs的血小板偏向。该研究揭示了Pbx1作为衰老相关转录网络枢纽的作用，为理解HSC衰老机制和开发干预策略提供了新见解。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用以下关键技术方法：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析不同年龄HSCs和CD41⁺ SLAM-LSK细胞的转录组；2）微调基于Transformer的预训练模型Geneformer，结合注意力展开（attention rollout）和计算机模拟扰动（in silico perturbation）推断基因调控网络（GRN）和候选枢纽因子；3）批量RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）分析细胞因子刺激前后及Pbx1过表达后的转录组和染色质可及性变化；4）转录因子（TF）筛选，通过逆转录病毒文库（143个造血相关TF）在年轻HSCs中过表达，以CD48表达变化作为分化替代标志；5）体内竞争性骨髓移植（BMT）和5-氟尿嘧啶（5-FU）损伤模型验证Pbx1的功能。

**研究结果**
**Old HSCs coexist with transcriptional features of both the most primitive HSCs and megakaryocytic progenitors**
通过scRNA-seq分析，研究人员将年轻和衰老HSCs及CD41⁺ SLAM-LSK细胞分为五个簇：Young-HSC、Old-1、Old-2、H2B-GFP-low和CD41⁺。衰老HSCs中同时富集两种程序：与原始HSC相关的Group 1基因和MolO特征，以及与巨核细胞/血小板谱系相关的Group 2基因。发育时间序列分析显示，Group 1基因表达在胚胎期E18.5即开始增加，而Group 2基因表达在出生后4–8周开始增加，表明衰老相关基因特征的获得是一个从生命早期开始的连续过程。

**Impaired differentiation-linked chromatin remodeling and persistent accessibility of age-associated regulatory regions in old HSCs**
通过RNA-seq和ATAC-seq分析细胞因子刺激26小时后的HSCs，研究人员发现衰老HSCs在分化相关位点（如Pu.1、NF-κB基序）的染色质可及性较低，且刺激后变化不大；同时，与Group 1基因和HOX基序相关的基因组区域在衰老HSCs中保持高可及性，表明衰老HSCs存在相对僵硬的表观遗传状态。

**Fine-tuning of a pretrained Geneformer enables identification of key transcriptional networks coordinating dual aging signatures**
通过微调Geneformer并进行计算机模拟扰动，研究人员预测Pbx1、Mecom、Selp和Hlf等基因在过表达时可使年轻HSCs向衰老表型转变，而Spic、Sox4和Gata1则向年轻状态转变。模型还预测了Pbx1在衰老GRN中的枢纽作用。

**Identification of Pbx1 as a key TF that confers age-related transcriptional features upon HSCs**
通过TF筛选（以CD48表达变化为标志），研究人员发现Pbx1和Arid5b是候选因子。qPCR验证Pbx1在衰老HSCs中表达上调。在年轻HSCs中过表达Pbx1可降低CD48表达，重现衰老表型；在衰老HSCs中敲低Pbx1或Pbx3可上调CD48。注意力展开网络分析显示，Pbx1模块在衰老HSCs中特异性扩大，且Pbx1处于核心HSC TF、巨核细胞基因和衰老HSC基因三个簇的交界处。

**Pbx1 activates a core transcriptional network shared by aging and stemness**
Pbx1过表达后的RNA-seq和ATAC-seq分析显示，yPbx1与oMock共享73.3%的上调基因，包括HSC相关基因Hlf、Procr和巨核细胞相关基因Pf4。GSEA分析表明Pbx1优先富集Group 1基因和原始HSC基因。ATAC-seq显示Pbx1过表达导致HOX基序可及性增加，类似衰老HSC的表观状态。网络分析进一步证实Pbx1过表达在年轻HSCs中形成大模块，而敲低后衰老HSCs网络收缩。

**Pbx1 is responsible for platelet bias in old HSCs**
体内移植实验显示，过表达Pbx1的年轻HSCs在移植后2周表现出红细胞生成减少和血小板偏向；敲低Pbx1的衰老HSCs则血小板偏向减轻。在老年小鼠中使用Pbx1抑制剂（T417）后，可轻度改善5-FU损伤后的造血恢复。机制上，Pbx1通过抑制Gata1表达来减少红系输出，而衰老HSCs中Gata1诱导受损。

**讨论与结论**
本研究表明，定义干细胞身份的遗传网络与衰老相关网络共享核心成分，其中Pbx1在调控中发挥关键作用。Pbx1主要调控Group 1基因（与原始HSC相关），而非全部衰老相关变化。Pbx1不能解释IRF、AP-1或FoxO靶序列的富集，提示衰老是多因素过程。Pbx1通过抑制Gata1表达导致红系输出减少，但髓系偏向和重建能力下降并未在观察期内与Pbx1过表达直接关联。研究还展示了基于深度学习的GRN模型在捕捉稀有干细胞群体衰老相关细微差异中的潜力。Pbx1作为衰老转录程序的核心整合因子，其发现为理解老年个体血液病理学提供了重要见解，可能涉及血小板相关的年龄相关心血管事件，并为克隆造血和白血病进展提供了潜在底物。结论：衰老HSCs中Pbx1激活的保守转录网络将早期生命轨迹与生理性HSC衰老和年龄相关血液疾病联系起来。