δ2-原钙黏蛋白组织平行的间接基底神经节回路

《SCIENCE ADVANCES》：δ2-Protocadherins organize parallel indirect basal ganglia circuits

　　

基底神经节（basal ganglia, BG）包含多个平行神经回路，每个回路可能控制不同的行为。然而，不同的平行BG回路是如何在分子水平上组织的尚不清楚。在此，研究人员展示了两种δ₂-原钙黏蛋白（δ₂-protocadherins, PCDHs），即PCDH17和PCDH10（均为同嗜性细胞黏附分子），建立并定义了两种不同的间接BG回路，这些回路调节不同的行为。PCDH17和PCDH10在BG中呈互补表达模式，从解剖学上定义了两个平行的间接BG连接。间接通路特异性的Pcdh17和Pcdh10条件性敲除（conditional knockout, cKO）小鼠表现出间接BG回路以区域偏好方式建立受损。最后，Pcdh17 cKO小鼠在任务学习中表现出缺陷，而Pcdh10 cKO小鼠在运动/感觉习惯化中表现出缺陷。这些结果将PCDH17和PCDH10确定为调节不同行为的两种不同间接BG回路的分子组织者，并揭示了组织平行BG回路的分子机制。

**论文解读：δ₂-原钙黏蛋白组织平行的间接基底神经节回路**

**研究背景与问题**

基底神经节（basal ganglia, BG）是大脑皮层下的一组核团，包括纹状体、苍白球外侧部（external globus pallidus, GPe）、苍白球内侧部（internal globus pallidus, GPi）、黑质（substantia nigra, SN；分为网状部substantia nigra pars reticulata, SNr和致密部substantia nigra pars compacta, SNc）和丘脑底核（subthalamic nucleus, STN）。纹状体接收皮层输入，并通过直接通路（direct pathway）投射至GPi/SNr，或通过GPe和STN的间接通路（indirect pathway）投射。不同皮层区域以拓扑方式投射至BG的不同区域，构成功能分离的平行回路（如边缘回路、联合回路和感觉运动回路）。尽管这些平行回路的解剖分布在小鼠中已有描述，但其分子组织机制尚不清楚。BG回路缺陷与多种神经精神疾病（如帕金森病、自闭症谱系障碍、强迫症、精神分裂症和抑郁症）相关，因此理解平行BG回路的组织方式可为治疗这些疾病提供潜在策略。

**研究内容与结论**

研究人员假设，两种δ₂-原钙黏蛋白（PCDH17和PCDH10）作为同嗜性细胞黏附分子，可能作为平行BG回路的分子组织者。通过免疫染色、基因敲除小鼠、病毒示踪、电生理和行为学实验，揭示了PCDH17和PCDH10分别定义两条功能不同的间接BG回路，并调节不同行为。该研究发表在国际顶级期刊《SCIENCE ADVANCES》上。

**关键技术方法**

主要技术包括：1）免疫荧光染色和原位杂交，分析PCDH17和PCDH10在BG亚区的表达模式；2）利用CRISPR-Cas9系统生成Pcdh17和Pcdh10条件性敲除（conditional knockout, cKO）小鼠（与A2A-Cre小鼠交配实现间接通路棘状投射神经元特异性敲除）；3）使用AAV（腺相关病毒）介导的逆行示踪、顺行跨突触示踪（AAV1-hSyn-Cre）和光遗传电生理记录，验证突触连接；4）通过全细胞膜片钳记录检测自发兴奋性和抑制性突触后电流；5）行为学测试包括触摸屏操作学习任务（视觉辨别学习与反转学习）、旷场实验、听觉惊吓反应及习惯化实验。样本均来自小鼠，未注明特定队列。

**研究结果**

**PCDH17和PCDH10定义的平行BG回路**
通过双染和共染实验，研究人员发现PCDH17和PCDH10在BG各亚区（纹状体、GPe、GPi、SNr）呈互补表达模式：PCDH17主要表达于前纹状体、GPe内侧和SNr后部；PCDH10主要表达于后纹状体、GPe外侧和SNr前部。两种蛋白均富集于纹状体小体（striosome），但也存在于基质区。与GPe分子标记（PV、Lhx6、Calbindin）的比较表明，PCDH定义的架构与已知分子框架不完全一致，而是代表BG回路特化的额外分子维度。

**PCDH17和PCDH10定义平行iSPN轴突连接**
利用EGFP敲入小鼠和iSPN特异性AAV示踪，研究人员发现PCDH17⁺ iSPN（位于前纹状体）投射至PCDH17⁺ GPe内侧区，而PCDH10⁺ iSPN（位于后纹状体）投射至PCDH10⁺ GPe外侧区。VGAT和Gephyrin共染证实了突触特异性配对。顺行跨突触追踪（AAV1-hSyn-Cre）和光遗传电生理记录进一步证明，前纹状体iSPN与内侧GPe神经元形成功能性抑制性突触，后纹状体iSPN与外侧GPe神经元形成功能性突触，揭示了PCDH依赖的平行连接。

**iSPN特异性Pcdh17和Pcdh10 cKO小鼠的生成**
通过将Pcdh flox小鼠与A2A-Cre小鼠交配，获得iSPN特异性cKO小鼠。免疫染色和Western blot证实PCDH17和PCDH10在iSPN中特异性缺失，而在dSPN、皮层、海马和丘脑中的表达正常，且两种PCDH的表达互不影响。

**iSPN-Pcdh cKO小鼠中区域特异性SPN异常聚集**
在3–4周龄的Pcdh17 cKO小鼠中，前纹状体（而非后纹状体）出现D1R和D2R信号的异常聚集，iSPN和dSPN的最近邻距离减小。在Pcdh10 cKO小鼠中，后纹状体（而非前纹状体）出现类似异常。P0时未见差异，表明异常聚集发生在出生后P0至P28期间。SPN胞体大小和树突复杂性正常，提示分布变化而非形态变化。

**iSPN-Pcdh cKO小鼠中iSPN轴突靶向正常**
利用A2A-Cre;RosaSTOP-tdT;Pcdh^flox-EGFP小鼠，研究人员发现PCDH17⁺和PCDH10⁺ iSPN的轴突在GPe中的靶向区域和密度在cKO与杂合子之间无差异，表明PCDH缺失不影响轴突投射模式。

**iSPN-Pcdh cKO小鼠中GPe抑制性突触受损**
在2周龄Pcdh17 cKO小鼠中，内侧GPe的VGAT密度降低，外侧GPe的VGAT大小增加；在Pcdh10 cKO小鼠中，外侧GPe的VGAT密度降低。iSPN特异性分析（tdTomato标记）证实了VGAT密度的区域选择性降低，而Gephyrin无变化。电生理记录显示，Pcdh10 cKO小鼠外侧GPe中sIPSC频率降低，振幅不变，提示抑制性突触前功能受损。2月龄成年小鼠中，突触缺陷持续存在。体外共培养实验表明PCDH17和PCDH10不足以诱导新突触形成，提示其可能稳定突触而非诱导突触。

**iSPN-Pcdh cKO小鼠纹状体中iSPN上的突触受损**
在2周龄cKO小鼠中，iSPN树突上的VGLUT1和VGLUT2兴奋性突触前密度在Pcdh17 cKO和Pcdh10 cKO的纹状体前部和后部均降低，PSD-95密度也降低。电生理记录显示，Pcdh17 cKO小鼠前纹状体iSPN的sEPSC振幅降低，后纹状体频率升高；Pcdh10 cKO小鼠后纹状体iSPN的sEPSC频率降低，振幅不变。dSPN的sEPSC无变化，表明异常聚集不影响这些突触表型。短时程可塑性分析显示，Pcdh17 cKO小鼠丘脑-纹状体突触的重复刺激诱发抑制减弱。此外，iSPN胞体上的抑制性突触（VGAT）密度在两种cKO的纹状体前部和后部均降低，Gephyrin无变化。

**Pcdh17 cKO小鼠任务学习受损，Pcdh10 cKO小鼠无此缺陷**
在触摸屏视觉辨别学习任务中，Pcdh17 cKO小鼠的正确答案率下降，所需总试次数和总错误数增加，而Pcdh10 cKO小鼠表现正常。在反转学习任务中，Pcdh17 cKO小鼠在早期阶段（第3–4天）正确率下降，总错误数增加，且在第2–3天出现更多持续性错误，提示行为灵活性降低。两种cKO小鼠的反应潜伏期均正常。

**Pcdh10 cKO小鼠运动/感觉习惯化减少，Pcdh17 cKO小鼠无此缺陷**
在旷场实验中，Pcdh10 cKO小鼠在5–15分钟内的运动距离显著高于对照，表明运动习惯化受损，而Pcdh17 cKO小鼠正常。听觉惊吓反应测试中，两种cKO小鼠的惊吓反应幅度正常，但Pcdh10 cKO小鼠在40–50次重复刺激后惊吓反应未降低，表明感觉习惯化受损。焦虑相关行为（旷场中心时间、高架十字迷宫、明暗箱）和前脉冲抑制在两种cKO中均正常，排除焦虑和感觉运动门控的影响。

**讨论与结论**

讨论部分指出，PCDH17和PCDH10不仅解剖上定义平行间接BG回路，还分别与任务学习和感觉运动习惯化相关的功能回路组织有关。其互补表达和选择性同嗜性相互作用允许特异性突触控制，从而调节不同行为。PCDH定义的架构与经典分子标记（如Lhx6、PV）不完全重叠，代表BG回路组织的额外黏附分子层。在突触组织方面，iSPN特异性敲除导致的突触缺陷比全局敲除更严重，可能源于PCDH表达不匹配（pre-与post-侧不对称）破坏突触稳定性。体外实验表明PCDH17和PCDH10不能诱导新生突触，支持其稳定作用。此外，PCDH17和PCDH10在BG中的表达具有部分重叠，共表达神经元可能形成分子匹配的亚回路或作为桥梁群体。研究还指出，PCDH17和PCDH10与不同神经精神疾病（如双相障碍/重性抑郁障碍与PCDH17，自闭症谱系障碍/强迫症与PCDH10）的关联，提示其通过不同间接BG回路缺陷导致疾病症状。研究局限性包括：轴突靶向和树突形态正常，但SPN异常聚集可能产生次级效应；A2A-Cre在皮层和海马也有重组，可能影响表型。未来需用光遗传和化学遗传策略直接验证特定回路功能。

**研究结论**：PCDH17和PCDH10是两种不同间接BG回路的分子组织者，分别调节任务学习和运动/感觉习惯化，揭示了平行BG回路的分子组织机制。