《Biotechnology Advances》：CRISPR/Cas trans-cleavage activity in pathogen detection: research progress and innovations
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•深入探讨 CRISPR/Cas 反式切割机制，重点关注病原体检测。•涵盖 Cas1–Cas14 系统，重点关注 Cas9、Cas12、Cas13 和 Cas14。•讨论当前局限性及提高检测可靠性的策略。引言病原体目前在公共卫生、生物安全、社会稳定和经济发展等多个领域产生广泛
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深入探讨 CRISPR/Cas 反式切割机制，重点关注病原体检测。
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涵盖 Cas1–Cas14 系统，重点关注 Cas9、Cas12、Cas13 和 Cas14。
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讨论当前局限性及提高检测可靠性的策略。
引言
病原体目前在公共卫生、生物安全、社会稳定和经济发展等多个领域产生广泛影响。快速病原体检测对于疫情控制、临床分诊和抗菌药物管理至关重要。在这种情况下，诊断价值不仅取决于分析灵敏度，还取决于完整工作流程能否在时间、设备、生物安全、成本和操作人员专业知识限制下，从预期样本中提供可靠结果。新兴的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）关联蛋白（Cas）诊断系统正显示出巨大的发展潜力。
CRISPR/Cas 系统已成为病原体核酸检测的多用途工具。与等温扩增结合时，CRISPR/Cas 检测能提供比常规聚合酶链反应（PCR）和实时定量聚合酶链反应（qPCR）更简单的温度控制，同时具备高分析灵敏度和序列特异性（Peng et al., 2025）。微流控平台、生物传感器、纸基色谱和其他便携式技术进一步扩展了这些检测在标准实验室仪器之外的使用。然而，它们的实际价值取决于样本制备、扩增、检测和结果解读能否整合到一个可靠的工作流程中。
Cas 身份仍然很重要，因为它定义了首选靶标底物、引导要求、切割模式和反应条件。Cas9 和 Cas12 主要用于 DNA 靶标，而 Cas13 主要用于 RNA 靶标，Cas14 适用于单链 DNA（图 1）。这些分配是有用的但不是绝对的，因为最近的研究扩大了几个效应器的靶标范围。检测限和出结果时间还取决于样本恢复、靶标富集、Cas 激活、报告化学、读出和阈值设置，这些都受靶标丰度和基质抑制剂的影响。
几篇综述已经建立了 CRISPR 诊断的技术基础，但大多数围绕一两个独立问题总结和分析该领域的进展和问题。Kaminski 等人调查了不断扩展的诊断工具箱，特别关注检测格式、预扩增和读出策略（Kaminski et al., 2021）。Rahimi 等人更专注于靶标识别机制及其在病毒和癌症生物标志物传感中的应用（Rahimi et al., 2024），而 Zhou 等人强调了工程和转化挑战（Zhou et al., 2026）。总的来说，这些研究提供了平台开发的广泛描述。在比较不同研究结果时，较少关注将 Cas 效应器的贡献与样本制备、扩增、信号转导和验证设计的贡献区分开来。
因此，本综述比较了常用的 2 类效应器（Cas9、Cas12、Cas13 和 Cas14）以及 Cas1 蛋白和较少讨论的 1 类系统，如 I 型和 III 型 CRISPR 相关组分。以切割机制为主要框架，我们首先对不同 Cas 系统进行分类和比较。然而，在此框架内，我们的分析遵循整个诊断工作流程——从样本制备和靶标富集到 Cas 激活、信号生成和最终读出。这种全面的讨论使我们能够确定检测性能是否归因于 Cas 效应器的内在特性，还是源于扩增和传感模块的增强。还结合了最新的机制发展，包括据报道在特定双 RNA 引导条件下 Cas9 的靶标激活反式切割活性（Chen et al., 2025）、改变金属离子条件下 Cas12a 的直接 RNA 识别（Zhao et al., 2026），以及具有调节反式切割活性和改进靶标特异性的工程化 Cas13a 变体（Zhang et al., 2026）。因此，本综述的讨论并非作为记录灵敏度的列表，而是根据消除的瓶颈、引入的权衡以及该进步可能产生重要影响的应用背景。我们比较了不同 CRISPR 系统之间的灵敏度、特异性、多重检测能力和临床局限性，总结了多层优化策略，包括 crRNA 重新设计、Cas 蛋白工程、离子调节和纳米材料整合，并进一步分析了多样化 CRISPR/Cas 系统在便携式病原体诊断设备中的发展趋势和实际潜力。
章节摘要
CRISPR/Cas 系统：病原体检测中的机制与应用
CRISPR/Cas 系统包含三个关键组分：CRISPR 阵列、Cas 蛋白和向导 RNA。CRISPR 结构由交替的短重复序列与特异性间隔序列组成（图 2）。Cas 蛋白是 CRISPR/Cas 系统中的核心功能元件，分为两大类：1 类（I 型、III 型、IV 型）和 2 类（II 型、V 型和 VI 型）（Makarova et al., 2018）。2 类效应器——包括 Cas9、Cas12、Cas13 和 Cas14——是
讨论与结论
常规核酸扩增仍然是病原体检测的核心，但它们对多步样本处理、经过培训的人员和实验室仪器的依赖可能会限制大规模疫情期间的分散部署（Jin et al., 2025）。CRISPR/Cas 诊断提供可编程的靶标识别和灵活的读出架构；然而，它们的实际价值取决于完整的样本到结果工作流程的性能，而不是生化
资助
本工作得到了 国家自然科学基金 [资助 32302874]；以及 吉林省科技发展规划计划 [资助 20250203114SF] 的支持。
竞争利益声明
作者声明以下可能被视为你潜在竞争利益的财务利益/个人关系：Haili Zhang 报告获得了 中国国家关键研究与开发计划 的资金支持。Pei Huang 报告获得了 吉林省科技发展规划计划 的资金支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的竞争财务利益或可能
Rong Gao|Hongli Jin|Tianyi Zhang|Haili Zhang|Pei Huang|Hualei Wang
