PDHA1过度激活驱动代谢重编程促进内皮细胞衰老

《Research》：PDHA1 Hyperactivation Orchestrates Metabolic Reprogramming Promoting Endothelial Senescence

　　

尽管近期研究已建立代谢重编程与炎症性衰老之间的联系，但血管衰老中的特定代谢驱动因素仍未完全明确。在此，研究人员系统表征了原代衰老内皮细胞（ECs）的衰老表型及靶向代谢组学谱，鉴定出丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α（PDHA1）依赖性代谢转变作为细胞衰老的一个标志。利用D-半乳糖诱导的衰老模型，研究人员证明内皮特异性Pdha1敲低可减轻肺血管内皮衰老及相关功能衰退。进一步研究揭示，PDHA1过度激活破坏线粒体稳态，导致线粒体活性氧（mtROS）过量产生、氧化性线粒体DNA（mtDNA）损伤及随后的胞质mtDNA释放，从而触发环GMP-AMP合酶（cGAS）介导的衰老。机制上，PDHA1在赖氨酸336（K336）位点乳酸化水平降低增强了其活性，并促进丝氨酸293（S293）位点去磷酸化。这种翻译后修饰的交叉对话增强了PDHA1激活，驱动了促衰老代谢转变。综上，研究结果阐明，先前未被认识的PDHA1过度激活促进了内皮细胞衰老。

**论文解读：PDHA1过度激活驱动代谢重编程促进内皮细胞衰老**

**研究背景、现存问题与研究意义**

年龄相关的血管功能衰退是多种肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺纤维化（PF））发病机制的关键诱因。肺血管内皮细胞（PVECs）作为肺泡-毛细血管屏障的主要结构成分，执行着重要的生理功能。衰老过程中，PVECs在基因表达、增殖能力和细胞结构上发生深刻变化，损害内皮完整性，加速疾病进程。尽管已知葡萄糖代谢通路失调是诱导内皮衰老的重要因素，但代谢重编程驱动血管衰老的具体分子机制仍不明确。丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）作为连接糖酵解与线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的关键枢纽，其催化亚基PDHA1的活性受可逆磷酸化精细调控，然而PDHA1在内皮衰老中的作用尚属空白。研究人员通过系统表征衰老内皮细胞的代谢特征，发现PDHA1过度激活驱动的代谢转变是内皮衰老的关键驱动因素，并揭示了其通过乳酸化修饰与磷酸化调控的交叉对话触发cGAS-STING通路的机制。该研究丰富了血管衰老的代谢调控理论，为靶向PDHA1治疗血管衰老相关疾病提供了新策略。论文发表在《Research》。

**主要关键技术方法**

研究人员首先从自然衰老小鼠（18月龄）中分离原代PVECs，结合靶向代谢组学分析（利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）和MetaboAnalyst平台）鉴定差异代谢物并与京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库比对。采用Seahorse XF24分析仪进行细胞线粒体压力测试以测定氧消耗速率（OCR）。通过构建内皮特异性Pdha1基因敲除小鼠（Pdha1^ΔEC，采用Cre/loxP系统，与Tek-CreERT2小鼠交配），并结合D-半乳糖（D-gal）诱导的加速衰老模型，进行行为学测试（旷场实验、Y迷宫、高架十字迷宫）及肺组织形态学分析。利用免疫共沉淀（Co-IP）和Western blot检测PDHA1乳酸化与磷酸化修饰，并采用PDHA1-K336R突变体验证位点特异性功能。样本队列来源包括小鼠（C57BL/6J，购自北京维通利华）及COPD和特发性肺纤维化（IPF）患者肺组织（来自中南大学湘雅医院）。

**研究结果**

**1. 衰老PVECs表现出非经典葡萄糖代谢重编程，偏向OXPHOS而非糖酵解**
通过靶向代谢组学分析，研究人员发现自然衰老小鼠PVECs中三羧酸（TCA）循环中间代谢物积累，而糖酵解代谢物减少；Seahorse分析显示OCR、ATP偶联呼吸和最大呼吸能力均升高，OXPHOS相关蛋白（ATP5A、UQCRC2、MTCO1、SDHB和NDUFB8）表达上调，乳酸产量降低，表明衰老PVECs呈现出增强的OXPHOS和受限的糖酵解。

**2. 衰老肺内皮细胞中PDHA1过度激活**
在衰老PVECs及D-gal诱导的衰老模型中，PDHC活性升高，而PDHA1抑制性位点Ser293（S293）磷酸化水平显著降低，而Ser300和Ser232位点磷酸化水平不变。免疫荧光共定位显示，在衰老小鼠、COPD和IPF患者肺组织中，p21与CD31阳性内皮细胞共定位，且p-PDHA1^S293水平降低，证实PDHA1活性增强与肺内皮衰老相关。

**3. 内皮特异性Pdha1敲除保护小鼠免受D-gal诱导的衰老相关行为缺陷**
构建Pdha1^ΔEC小鼠后，D-gal诱导的加速衰老模型引起的行为缺陷（如旷场实验中中央区域穿越次数减少、Y迷宫自发交替率降低、高架十字迷宫闭臂时间增加）在Pdha1^ΔEC小鼠中得到显著改善，表明内皮PDHA1缺失可缓解衰老相关的认知下降和焦虑样行为。

**4. 内皮特异性Pdha1缺失减轻体内肺内皮衰老**
组织学分析显示，Pdha1^ΔEC小鼠减轻了D-gal诱导的肺泡结构破坏和屏障损伤（紧密连接蛋白ZO-1连续性改善）。分离的PVECs中，SA-β-gal阳性细胞比例降低，衰老相关标志物（p16、p19、p21、p53、Il-1β、Il-18）的mRNA和蛋白水平均下调，证实PDHA1是肺内皮衰老的关键驱动因子。

**5. PDHA1依赖的代谢重编程在体外调控PVECs衰老**
在PVECs中沉默Pdha1可逆转D-gal诱导的OCR升高、ATP偶联呼吸和最大呼吸增强，并恢复乳酸产量，同时减少SA-β-gal阳性细胞、增加Ki67阳性细胞，下调p53、p21、p16和γ-H2AX蛋白水平。PDHA1竞争性抑制剂3-氟丙酮酸（3-FP）也获得类似效果，表明PDHA1驱动的代谢转变是衰老的驱动力。

**6. PDHA1^S293去磷酸化诱导的PDHA1过度激活促进内皮细胞衰老**
PDK抑制剂AZD7545处理PVECs后，PDHA1 S293磷酸化降低、PDHC活性升高，引起OCR、ATP偶联呼吸、最大呼吸及OXPHOS蛋白表达上调，同时乳酸产量降低，并诱导SA-β-gal阳性细胞增多、Ki67减少及衰老标志物升高。ATP合酶抑制剂寡霉素可逆转该效应，说明OXPHOS增强是PDHA1激活促衰老的关键。过表达磷酸缺陷型PDHA1-S293A突变体同样增强了PDHC活性并诱导衰老表型。

**7. PDHA1在Lys336位点乳酸化降低促进其去磷酸化并驱动PVECs衰老**
Co-IP实验显示，D-gal诱导的衰老PVECs中PDHA1乳酸化水平降低。过表达去乳酸化模拟突变体PDHA1-K336R可增加PDHC活性，并降低PDHA1整体磷酸化水平，尤其促进S293去磷酸化。乳酸补充可逆转D-gal所致的S293磷酸化降低和PDHC活性升高。PDHA1-K336R突变体还导致乳酸产量减少、OCR升高、OXPHOS蛋白上调，并诱导SA-β-gal阳性细胞增多和衰老标志物表达升高，进一步证实了K336乳酸化与S293磷酸化之间的负调控交叉对话。

**8. PDHA1激活驱动mtDNA-cGAS-STING介导的内皮细胞衰老**
AZD7545诱导的衰老PVECs中，mtROS水平升高、线粒体膜电位（JC-1比率）降低，且胞质mtDNA（Nd1、Cytb、D-loop）积累增加。cGAS-STING通路关键蛋白（cGAS、p-TBK1^Ser172、p-IRF3^Ser396）表达上调。从Cgas基因敲除（Cgas^KO）小鼠分离的PVECs中，AZD7545诱导的SA-β-gal阳性细胞减少、Ki67阳性细胞增多，衰老标志物表达下降，证实cGAS-STING通路是PDHA1过度激活驱动衰老的下游效应机制。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，自然衰老和D-gal诱导的衰老PVECs均上调氧化葡萄糖代谢并限制糖酵解通量，这不同于传统认为的线粒体损伤和OXPHOS降低是衰老标志的观点。研究人员提出，PDHA1过度激活导致的OXPHOS增强是一种代偿性高代谢应激状态，伴随mtROS过量产生，导致mtDNA氧化损伤并释放至胞质，进而激活cGAS-STING通路，启动衰老程序。机制上，PDHA1 K336位点乳酸化水平降低促进了S293去磷酸化，从而增强PDHA1活性。该研究首次揭示了乳酸化修饰与磷酸化修饰之间的交叉对话在调控PDHA1活性及内皮衰老中的作用，为血管衰老的代谢调控提供了新机制。研究结论：综上所述，研究人员证明PDHA1过度激活依赖的代谢转变是内皮细胞衰老的关键驱动因素。机制上，研究人员揭示了一条先前未被识别的通路，即PDHA1乳酸化降低促进其去磷酸化，进而引发代谢转变，最终促进衰老。该研究因此揭示了衰老内皮细胞中一个新的调控机制，并提出将靶向PDHA1过度激活作为对抗血管衰老的可行策略。