《Applied and Environmental Microbiology》：Characterization of vaginal lactobacilli from South African women toward the development of a biotherapeutic to optimize the vaginal microbiome
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HIV仍然是世界上最严重的医疗保健挑战之一，撒哈拉以南非洲的青春期少女和年轻女性感染风险尤其高。细菌性阴道病（Bacterial vaginosis, BV）是HIV感染的关键风险因素，但目前的治疗策略有限。最优的阴道乳杆菌通过免疫调节和抗菌活性（部分由乳酸介
HIV仍然是世界上最严重的医疗保健挑战之一，撒哈拉以南非洲的青春期少女和年轻女性感染风险尤其高。细菌性阴道病（Bacterial vaginosis, BV）是HIV感染的关键风险因素，但目前的治疗策略有限。最优的阴道乳杆菌通过免疫调节和抗菌活性（部分由乳酸介导）保护机体免受BV和HIV感染。为了开发适用于非洲女性的活体生物治疗剂，研究人员从25名BV阴性的南非女性中采集了181株阴道乳杆菌分离株。从中选择50株，使用阴道上皮细胞评估炎症反应、D-和L-乳酸及乳酸产量，以及培养酸化。除了一株唾液乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）外，卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）分离株对培养基的酸化程度最高，并且产生最多的D-和L-乳酸。不同乳杆菌菌株引起的炎症细胞因子反应各异，其中Lb. crispatus引起的细胞因子生成水平最低，而一些菌株则诱导了显著的炎症反应。当综合评估所有特性时，Lb. crispatus菌株展现出最理想的生物治疗剂特性。对10株Lb. crispatus分离株进行全基因组序列分析后，在所有分离株中鉴定出推定的细菌素（bacteriocins）和完整的前噬菌体（prophage）序列，而未检测到抗菌素耐药性元件。重要的是，大多数Lb. crispatus分离株彼此之间的亲缘关系较与其他地理区域的分离株更为密切，这支持了活体生物治疗剂需针对目标人群进行定制的必要性。
**论文解读：基于南非女性阴道乳杆菌特征分析开发定制化活体生物治疗剂**
**研究背景与问题**
撒哈拉以南非洲（SSA）是全球HIV流行中心，60%以上的HIV感染者集中于此，其中15-24岁新发感染中77%为青春期少女和年轻女性。细菌性阴道病（BV）是HIV感染的关键风险因素，其特征是保护性乳杆菌减少，代之以非最优的兼性厌氧菌和严格厌氧菌。在南非，42%的15-24岁女性和41%的25-49岁女性受BV影响，该病与女性生殖道（FGT）炎症相关，使HIV性传播风险增加高达4.4倍。相比之下，定植有最优乳杆菌（尤其是卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus）的女性炎症水平低，HIV、其他性传播感染（STI）及BV风险降低。然而，当前BV治疗标准（抗生素）复发率高，且部分暴露前预防（PrEP）效果在BV患者中降低。因此，亟需开发通过重新定植最优乳杆菌来优化阴道微生物组的活体生物治疗剂（live biotherapeutic）。此前研究显示阴道微生物组组成存在种族和地理区域差异，但尚无包含非洲女性分离株的获批产品。本研究旨在从南非女性中分离并表征阴道乳杆菌，评估其生物治疗相关特性，为开发适用于非洲人群的活体生物治疗剂提供依据。论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。
**主要关键技术方法**
研究人员从南非开普敦MISC队列（美国国立卫生研究院资助）中招募25名BV阴性（Nugent评分0-3）、HIV阴性、未使用抗生素、未怀孕的性活跃女性（16-32岁）。使用月经杯采集宫颈阴道分泌物，在MRS琼脂上厌氧培养分离乳杆菌，通过16S rRNA基因测序鉴定。选择50株（来自18名女性，其中4名伴有STI）进行功能评估：测定厌氧培养24小时后上清液中D-和L-乳酸浓度及pH，计算乳酸产量；与VK2阴道上皮细胞共培养，检测IL-6、IL-8等炎症/抗炎细胞因子（Luminex法）；对10株Lb. crispatus进行PacBio全基因组测序（WGS），分析抗性基因（ResFinder、CARD）、质粒（PlasmidFinder）、前噬菌体（PHASTEST、checkV、Pharokka）和细菌素（BAGEL4）。
**研究结果**
**乳杆菌的分离**
从25名女性中分离出205株细菌，包括181株乳杆菌（72株Lb. crispatus、30株Limosilactobacillus reuteri、24株Lactobacillus jensenii、23株Lactobacillus gasseri、22株Limosilactobacillus vaginalis、7株Lactobacillus johnsonii、2株Ligilactobacillus salivarius、1株Limosilactobacillus coleohominis）及其他非嗜氧菌。Lb. iners虽常见但未分离（需额外培养基）。选择50株进行后续评估。
**乳酸产量与培养基酸化**
Lb. crispatus和Lb. jensenii产生最多D-乳酸（P=0.0033和P=0.0152 vs Lb. gasseri）。一株Lg. salivarius和两株Lb. johnsonii产生最多L-乳酸，Lb. crispatus其次（P=0.0047 vs Lb. jensenii）。Lb. crispatus总乳酸产量最高（P=0.0050 vs Lb. gasseri；P=0.0396 vs Lm. vaginalis）。总乳酸与pH呈负相关（R=-0.8023，P<0.0001）。计算乳酸浓度后，Lb. crispatus同样产生最多D-乳酸（P=0.0073 vs Lb. gasseri；P=0.0029 vs Lm. vaginalis）和L-乳酸（除Lg. salivarius外，P=0.0011 vs Lb. jensenii；P=0.0125 vs Lm. vaginalis）。
**乳杆菌诱导的炎症/抗炎细胞因子反应**
与阴道上皮细胞共培养后，多数乳杆菌引起的炎症细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5）反应低于非最优的阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）临床分离株，其中Lb. crispatus和Lb. jensenii与G. vaginalis差异显著。相反，乳杆菌诱导的抗炎细胞因子IL-1RA高于G. vaginalis（以1×10
5 CFU/mL浓度，P=0.0406 vs Lb. crispatus；P=0.0122 vs Lb. gasseri）。但部分乳杆菌及ATCC参考菌株诱导的炎症反应与G. vaginalis相当。仅一株Lb. gasseri使细胞活力降至80%以下。总体而言，Lb. crispatus引起的炎症细胞因子反应最低。STI阳性与阴性女性分离株的细胞因子反应无显著差异，但STI阳性者分离株的L-乳酸产量有降低趋势（P=0.0778）。
**根据生物治疗相关特性的总体排名**
综合评估D-乳酸、L-乳酸、pH、炎症和抗炎细胞因子后，Lb. crispatus排名最佳，前十名中多数为Lb. crispatus菌株。STI状态不影响总排名。
**Lb. crispatus分离株的全基因组分析**
对10株Lb. crispatus（包括3株最优菌株及7株表现各异者）进行WGS分析。平均基因组大小为2.53 Mbp（2.45-2.58 Mbp）。系统发育分析显示，南非分离株聚类形成独立分支，与ATCC 33820参考菌株、其他地理区域（美国、巴西、荷兰、意大利）及鸡源分离株分离。来自同一名参与者的两对菌株（PID162 2a与5a；PID173 1a与5a）高度相似（核苷酸同源性100%和99.99%），表明同一菌株可能多次被分离。未检测到抗菌素耐药性基因或染色体突变，也未发现质粒。D-和L-乳酸脱氢酶基因序列高度保守（同源性100%和99.7%），仅D-乳酸脱氢酶存在一个非非同义突变（V331A）。通过BAGEL4鉴定出5种推定细菌素编码基因：pediocin样细菌素penocin A、bacteriolysin enterolysin A、两拷贝helveticin J（所有菌株均有），以及线性唑/嗪类肽（LAPs，7/10菌株）。PHASTEST在所有菌株中均检出完整推定前噬菌体（checkV将PID40 D9的两个前噬菌体归类为基因组片段），这些前噬菌体与李斯特菌噬菌体B054、乳杆菌噬菌体Lc-Nu和phiadh最相似，但checkV和Pharokka鉴定为vB_Lcr_AB1和vB_Lga_AB1。序列比对显示部分菌株前噬菌体与参考数据库相似性有限，提示可能存在远缘关系。仅一株菌（173 1a）的前噬菌体序列映射到较小重叠群，可能代表诱导型前噬菌体。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究扩大了来自非洲女性的最优阴道乳杆菌特征表征数量，为开发针对该人群的活体生物治疗剂提供了关键资源。由于阴道微生物组存在种族和地理区域差异，且南非Lb. crispatus分离株彼此间亲缘关系较与其他地区更近，支持了生物治疗剂需定制化的观点。乳酸产量和炎症反应存在菌株水平变异，强调了严格筛选的必要性。Lb. crispatus在乳酸产生、酸化和低炎症方面表现最佳，但部分菌株（包括ATCC参考菌株）诱导显著炎症，与G. vaginalis相当。尽管WGS分析中乳酸脱氢酶基因高度保守，但乳酸产量差异可能源于丙酮酸利用竞争、葡萄糖输入效率、乳酸外排及低pH耐受性等因素。细菌素编码基因（penocin A、enterolysin A、helveticin J、LAPs）的存在可能提供竞争优势，但其功能需进一步验证。未检测到AMR基因和质粒，符合安全性要求，但建议结合表型评估。前噬菌体普遍存在，但未发现携带临床相关基因，需评估其诱导风险。局限性包括：使用VK2细胞系不能完全模拟体内条件；缺乏多次BV检测确认持续最优微生物组；STI组样本量小；未测试多菌株组合。结论部分（翻译原文总结）：观察到乳杆菌分离株在生物治疗相关特性上存在显著的物种和菌株水平差异。对六个不同物种的比较显示，Lb. crispatus分离株产生最多乳酸，显著降低培养基pH，并在体外引起最低的炎症细胞因子反应。通过WGS分析的10株Lb. crispatus分离株彼此间比与其他地理区域的分离株更相似，这支持了活体生物治疗剂需针对目标人群定制的必要性。在所有通过WGS分析的分离株中鉴定出推定细菌素和前噬菌体，而未检测到AMR抗性元件。下一步将对这些分离株进行进一步表征，包括评估多菌株组合是否改善性能，以开发潜在活体生物治疗剂，在FGT中建立最优微生物组。
