《Food Chemistry》：Active-site engineering of a GH2 bifidobacterial β-galactosidase for improved formation of
N-acetyl-lactosamine - a core structure of human milk oligosaccharides
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在本研究中，研究人员描述了一种直接的丙氨酸扫描策略，对Bbreβgal-II中参与糖结合的氨基酸残基进行活性位点工程。研究结果表明，工程化酶表现出整体活性降低，但LacNAc形成增加。突变酶的生化表征证实了其对GlcNAc的转糖基化活性提高。这项工作为通过β-
在本研究中，研究人员描述了一种直接的丙氨酸扫描策略，对Bbreβgal-II中参与糖结合的氨基酸残基进行活性位点工程。研究结果表明，工程化酶表现出整体活性降低，但LacNAc形成增加。突变酶的生化表征证实了其对GlcNAc的转糖基化活性提高。这项工作为通过β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）以更高产率酶法合成LacNAc提供了一种有前景的策略，该策略可能也适用于聚糖合成领域的其他糖苷水解酶（glycoside hydrolase, GH）。
**论文解读：GH2双歧杆菌β-半乳糖苷酶的活性位点工程用于改善N-乙酰乳糖胺的合成**
**研究背景**
人乳寡糖（human milk oligosaccharides, HMO）是母乳中重要的功能成分，具有益生元、抗微生物和抗病原体黏附等健康益处。HMO的核心结构通常以乳糖（lactose）为还原端，通过β-(1→3)或β-(1→4)键连接N-乙酰乳糖胺（N-acetyl-lactosamine, LacNAc）或乳糖-N-二糖（lacto-N-biose, LNB）单元。LacNAc不仅是HMO的核心结构，还是糖脂、糖蛋白以及ABO血型抗原的前体，并在癌症研究中作为生物标志物。目前，化学合成LacNAc存在产率低、使用有毒试剂等局限性，而酶法合成中，糖基转移酶需要核苷酸激活的糖基供体，不适用于大规模应用。糖苷水解酶（glycoside hydrolase, GH）通过转糖基作用（transglycosylation）合成LacNAc具有潜力，但β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, EC 3.2.1.23）通常优先形成β-(1→6)键的alloLacNAc，而非β-(1→4)键的LacNAc。此前，研究人员从婴儿分离的短双歧杆菌（Bifidobacterium breve DSM 20213）中克隆了GH2家族β-半乳糖苷酶Bbreβgal-II，其转糖基反应主要生成alloLacNAc，而非HMO核心结构LacNAc。因此，如何通过蛋白质工程提高LacNAc的产率是本研究的关键问题。该研究论文发表在《Food Chemistry》期刊上。
**主要技术方法**
研究人员利用AlphaFold3预测Bbreβgal-II的蛋白质结构，并与Arthrobacter sp. 32cB的β-D-半乳糖苷酶晶体结构（PDB: 6ZJQ）进行叠合，识别活性位点中与底物半乳糖形成氢键的氨基酸残基。通过丙氨酸扫描（alanine scanning）将Asp226、His405、Asn482、His558、Trp585和Asn621分别突变为丙氨酸，筛选出保留部分活性的突变体。采用分子对接（Protenix）和分子动力学模拟（openMM，AMBER ff14SB及GLYCAM_06j-1力场）分析野生型和H558A突变体的活性位点柔性。转糖基反应以乳糖（600 mM）为半乳糖基供体，N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine, GlcNAc, 600 mM）为受体，在37°C、600 rpm条件下反应24小时，产物通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）和核磁共振（NMR）进行定性和定量分析。酶动力学参数通过米氏方程拟合，并利用初始速率法测定GalNAc作为受体的转糖基偏好（k
GlcNAc/k
water）。
**研究结果**
**3.1 结构模型**
通过AlphaFold3预测的Bbreβgal-II单亚基结构与ArthβDG的叠合显示，活性位点环区高度保守（RMSD 0.93 ?），半乳糖位于活性位点裂隙中。同源二聚体模型揭示两个独立、表面暴露的活性位点，每个位点仅能容纳一个乳糖或半乳糖分子，GlcNAc位于口袋外部，提示该酶仅包含?1亚位点，且活性位点呈裂隙状，有利于糖受体接近。
**3.2 热点识别**
丙氨酸扫描结果显示，所有突变体均显著丧失酶活性，其中N482A和W585A完全失活，而N621A保留32.4%相对活性，H558A保留3.9%相对活性。序列比对表明，Asn482和Trp585高度保守，可能与催化残基Glu483（酸/碱）和Glu555（亲核试剂）的稳定有关；而His405、His558、Asn621和Asp226保守性较低，适合作为突变位点。
**3.3 GlcNAc转糖基产物的形成**
HPAEC-PAD分析显示，野生型Bbreβgal-II在70%乳糖转化时达到最高LacNAc摩尔产率4.8%，而H558A突变体在65%乳糖转化时达到13.2%摩尔产率（约30 g/L），比野生型提高约2.75倍。同时，alloLacNAc的产率在野生型和H558A中相似（约17.3%），但LacNAc在反应后期易被二次水解。饱和突变筛选得到的H558V突变体比活性更高（12 U/mg vs. H558A的3 U/mg），但其LacNAc最高产率（8.3%）低于H558A。转糖基偏好实验显示，H558A和H558V的k
GlcNAc/k
water值分别为11.63和16.40 M
-1，均高于野生型的5.42 M
-1，表明突变增强了酶对GlcNAc受体的偏好。
**3.4 GlcNAc转糖基产物的结构鉴定**
LC-MS分析确认反应产物中存在LacNAc和alloLacNAc，未检测到LNB。NMR对二糖和三糖组分进行详细分析，二糖主要成分为β-D-Galp-(1→6)-D-GlcpNAc（alloLacNAc）和β-D-Galp-(1→4)-D-GlcpNAc（LacNAc），后者为次要成分；三糖主要成分为β-D-Gal-(1→6)-[β-D-Gal-(1→4)]-D-GlcNAc和β-D-Gal-(1→3)-β-D-Gal-(1→6)-D-GlcNAc。四糖组分因量少仅确认还原端为GlcNAc。
**3.5 改变活性位点促进LacNAc合成**
分子动力学模拟表明，H558A突变体中，乳糖与催化残基Glu555的相互作用保持，但活性位点整体柔性增加，尤其是葡萄糖基团和Asn436-Gly439区域的波动显著增大。这导致底物结合能力下降（Km值无法测量，表现出非米氏动力学），同时增加了半乳糖基-酶中间体的移动性，有利于GlcNAc的C4羟基接近半乳糖基C1，从而形成β-(1→4)键。His558位于活性位点入口，靠近糖受体亚位点，突变为丙氨酸后扩大了空间，减少了位阻，使GlcNAc更容易进入活性位点口袋。
**讨论与结论**
讨论部分指出，His558与半乳糖O6形成氢键，并通过π-π相互作用稳定邻近的芳香族残基（Tyr528、Tyr1020、Phe618），突变后这些相互作用减弱，导致活性位点柔性增加。这种柔性增强降低了初始糖基化活性，但提高了转糖基相对水解的比例（T/H比），从而促进LacNAc形成。此外，突变体的热稳定性与野生型相似（T50为40-45°C），表明活性位点突变未显著影响整体蛋白稳定性。研究结论总结如下：首次通过活性位点工程改造双歧杆菌β-半乳糖苷酶，利用天然简单糖作为供体和受体，显著提高了LacNAc的合成产率。丙氨酸扫描策略简单直接，能够识别影响转糖基作用的活性位点残基，为酶法合成特定HMO结构提供了蓝图，并可能应用于其他糖苷酶。该策略可推动利用乳清中的乳糖和甲壳素废弃物中的GlcNAc进行绿色、可持续的LacNAc生产。
