β-环糊精介导的多肽 PPHG 与没食子酸共包埋：协同凝血酶抑制活性、增强的稳定性以及持续模拟胃肠道释放

《Food Bioscience》：β-Cyclodextrin-mediated co-encapsulation of peptide PPHG and gallic acid: Synergistic thrombin-inhibitory activity, enhanced stability, and sustained simulated gastrointestinal release

　　

摘要

君迁子来源肽 Pro-Pro-His-Gly (PPHG) 和没食子酸 (GA) 表现出协同抗凝血酶活性，但在口服递送过程中存在不稳定性和胃酸提前释放的问题。本研究优化了协同比例，并开发了一种 PPHG/GA-β-环糊精 (β-CD) 共包埋系统。采用棋盘法结合零相互作用潜力 (ZIP) 建模，确定了 2.5:1 (w/w) 的最佳 PPHG:GA 比例。以 1:2 (w/w) 的芯壁比制备的 PPHG/GA-β-CD 包合物 (ICs) 实现了对 PPHG 81.15 ± 1.68% 和对 GA 80.52 ± 0.11% 的包埋效率。结构表征（SEM、XRD、FTIR 和 ¹H NMR）支持非晶相的形成及提出的“内包埋/外组装”结构。热分析、界面电荷测量、分子对接和动态光散射进一步表明，与物理混合物相比，其热性能得到改善，并形成了平均直径更小、多分散性更低的亚微米级水基组装体。ICs 在环境压力（光、热、pH）和食品添加剂下表现出稳定性。在 INFOGEST 模拟消化中，ICs 分别将 PPHG 和 GA 的表观胃释放减少了 28.74% 和 34.83%，随后在肠道逐渐释放。模拟消化后，ICs 保留了 75.8% 的初始抗凝血酶活性，而游离 PPHG + GA 混合物仅保留 31.2%，并在肠道终点显示出高出 2.16 倍的抑制作用。该方法有效地稳定和口服递送了协同肽 - 多酚组合。

引言

血栓性疾病构成了全球主要的健康负担。鉴于合成抗凝剂伴随的巨大出血风险，开发安全有效的天然抗凝血酶抑制剂引起了越来越多的关注 (Agten 等，2021; L. Liu 等，2024; Wei 等，2026)。君迁子 (L.) 是一种药食同源植物，长期以来被用于促进血液循环和支持血管健康 (Hassan 等，2022)。我们此前分离并鉴定了四肽 Pro-Pro-His-Gly (PPHG) 和没食子酸 (GA)，后者是 D. lotus 中的主要多酚。这两种化合物均表现出独立的抗凝血酶活性，它们的组合可能产生显著的协同效应 (F. Li 等，2023; Villanueva-Bermejo 等，2024)。

然而，PPHG 和 GA 的有效口服共递送面临两个相互关联的挑战。首先，它们的协同抗凝血酶活性依赖于比例，需要确定最佳的组合比例。其次，亲水性 PPHG 和相对疏水性 GA 不同的理化性质，使得使用传统的单界面载体同时稳定它们变得困难。口服给药后，生物活性肽可能会受到酶解和变化的消化条件的影响 (Ahmed 等，2022; T. Xu 等，2023)，而诸如 GA 等酚类化合物易受光、热和氧诱导的降解，这限制了它们的加工和存储应用 (Tavares 等，2022; C. Zhang 等，2024)。更重要的是，胃阶段的提前释放和降解可能会减少两种成分在随后肠道释放和协同活性中的同时可用性 (H. Li 等，2024; Sabet 等，2021; Xie 等，2025)。因此，需要一种能够共包埋两种成分并提供胃保护的递送系统。与单独包埋相比，在同一载体单位内共包埋可能有助于促进两种成分在消化过程中的协调递送，从而支持它们的潜在协同活性。

β-环糊精 (β-CD) 具有用于客体包埋的疏水空腔和用于表面相互作用的亲水外部，是 PPHG/GA 共递送的合适主体材料 (Arruda 等，2024)。其空腔直径 (6.0–6.5 ?) 比 α-环糊精 (约 4.7–5.3 ?) 更适合容纳客体，且其相对较低的成本和一般认为安全 (GRAS) 的地位有利于其在食品体系中的应用 (Arruda 等，2024; R. Zhao 等，2023)。与羟丙基-β-环糊精 (HP-β-CD) 相比，天然 β-CD 具有固定的七葡萄糖环结构和明确的化学成分，而 HP-β-CD 包含具有异质取代位点和取代度的分子。虽然羟丙基化改善了水溶性，但也改变了空腔和边缘微环境， potentially 增加了主体 - 客体相互作用和批次控制的变异性。因此，选择天然 β-CD 构建当前的冻干系统以实现胃保护和控释，而 β-CD 衍生物可能在随后的配方优化期间进一步评估 (Z. Zhang 等，2024)。之前的研究表明，β-CD 包埋可以破坏多酚晶格，促进非晶复合物形成，并提供空间保护，从而改善水溶性、成分保留以及对光和热降解的抵抗力 (Catenacci 等，2020; Ho 等，2017; H. Li 等，2024)。其对胆汁盐的响应性也可能促进肠道释放 (Kou, Li 等，2024; Y. Xu 等，2023)。然而，现有研究主要集中在单组分包埋 (Y. Liu 等，2024)，对于 PPHG/GA 等协同肽 - 多酚系统的共负载、分子组装、最佳比例和协调释放仍了解不足。

为解决这些问题，制备了一种冻干 PPHG/GA–β-CD 超分子共包埋复合物。利用协同和包埋分析优化了 PPHG:GA 比例和芯壁比。利用结构表征和分子对接检查了提出的内包埋/外组装结构。随后使用标准化的 INFOGEST 模型评估了游离和包埋配方的稳定性、食品添加剂相容性以及胃肠道释放。本研究为协同肽 - 多酚系统的共包埋和口服递送提供了参考。

章节片段

材料

抗凝血酶肽 PPHG (Pro-Pro-His-Gly, 纯度 ≥95%) 由南京源泰生物科技有限公司（南京，中国）合成。没食子酸 (GA, 纯度 ≥98%) 和 β-环糊精 (β-CD, 纯度 ≥98%) 购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）。体外消化材料包括 α-淀粉酶（猪胰来源）、胃蛋白酶（猪胃粘膜来源）、胰酶（猪胰来源）、猪胆汁盐，均购自上海

协同抗凝血酶分析及比例测定

建立活性成分之间的最佳组合比例对于构建高效的共包埋递送系统至关重要。我们首先采用棋盘法分析 PPHG 和 GA 在不同浓度组合下的相互作用关系。

图 1A 显示，与单独使用任一药剂相比，联合使用 PPHG 和 GA 显著增强了抗凝血酶作用。为了量化这种相互作用，ZIP 模型计算了协同得分。结果（图 1B）

结论

本研究通过优化 PPHG:GA 和芯壁比，开发了一种冻干 PPHG/GA–β-CD 共包埋系统。结构分析支持了提出的内包埋/外组装排列，其中 GA 优先与 β-CD 空腔结合，PPHG 主要与外边缘结合。ICs 在环境压力和短期存储下显示出更好的保留性，减少了表观胃释放，逐渐肠道释放，并保留了更高的抗凝血酶

CRediT 作者贡献声明

任迪峰: 写作 - 审阅 & 编辑，指导，项目管理，资金获取，概念化。任海斌: 验证，软件，资源。李学富: 验证，调查。刘自涵: 验证，调查。曲自涵: 写作 - 初稿，可视化，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。陆军: 写作 - 审阅 & 编辑，指导，项目管理

未引用参考文献

Chen 等，2024; Ianevski 等，2022; Kou 等，2024; Kou 等，2024; Li 等，2023; Li 等，2022; Liu 等，2024; Xu 等，2023; Zhang 等，2024; Zhao 等，2023; Zhu 等，2021。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

资助声明

本工作得到了 中国农业科研体系 由 财政部 和农业农村部 (CARS-21) 以及 中央高校基本科研业务费 PTJS202625 的支持。

利益冲突声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能会影响本文所报告工作的客观性。

曲自涵 | 刘自涵 | 李学富 | 任海斌 | 任迪峰 | 陆军

北京林业大学生物科学与技术学院，北京市森林食品加工与安全重点实验室，河北省森林食物资源可持续利用与开发重点实验室，北京林业大学，北京 100083，中国