卡拉胶是一类从红藻中提取的高分子量硫酸化半乳聚糖，因其凝胶、增稠、稳定和乳化特性，被广泛用于食品、制药和生物医学应用 (Ghanbarzadeh, Golmoradizadeh, & Homaei, 2018; Rupert, Rodrigues, Thien, & Yong, 2022; Udo, Mummaleti, Mohan, Singh, & Kong, 2023)。此外，卡拉胶和其他源自海藻的多糖亲水胶体日益被视为用于可持续和活性包装的可再生生物聚合物 (Akbar & Mustari, 2024; Akbar, et al., 2026)。卡拉胶的主链由交替连接的 3-位β-d-吡喃半乳糖（G）和 4-位α-d-吡喃半乳糖（D）或 3,6-脱水-α-d-吡喃半乳糖（DA）残基组成，这些残基在不同位置进一步修饰有硫酸基团 (Campo, Kawano, Silva, & Carvalho, 2009; Zhu, Ni, Xiong, & Yao, 2021)。这些结构特征产生了多种卡拉胶类型和相当大的分子异质性。其中，主要由 G4S-DA 重复单元组成的 κ-卡拉胶和主要由 G4S-DA2S 重复单元组成的 ι-卡拉胶是最具商业相关性的类型 (图 S1) (van de Velde, 2008)。它们的理化性质受结构参数强烈影响，包括卡拉胶类型、聚合度、3,6-脱水半乳糖残基的分布和硫酸化模式 (Lo?c Hilliou, 2021; Loic Hilliou, Freitas Moraes, & Almeida, 2025; Jiang, Zhang, Ni, & Shao, 2021)。研究表明，κ-、ι- 和 κ/ι-混合卡拉胶与酪蛋白胶束的相互作用不同，并赋予乳凝胶不同的流变特性 (Arltoft, Ipsen, Madsen, & de Vries, 2007)。因此，对 κ- 和 ι-卡拉胶进行准确的表征对于阐明结构 - 功能关系、评估产品质量和支持市场监管至关重要。
然而，卡拉胶的精细结构分析仍然具有挑战性。天然卡拉胶大分子通常表现出高粘度、宽分子量分布、强静电效应和广泛的结构混合性 (Ning, Zhu, & Yao, 2024)。传统的自上而下方法，如核磁共振波谱 (NMR) (Stephanie, Eric, Sophie, Christian, & Yu, 2010; van de Velde, 2008) 和傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) (Z. Li, et al., 2024; Pereira, Amado, Critchley, van de Velde, & Ribeiro-Claro, 2009)，提供了有用的整体结构信息，但通常不足以分辨低丰度的异质基序或定量特定结构单元 (Dyrby, et al., 2004; Kravchenko, et al., 2020)。这种限制主要源于高分子量和结构异质性卡拉胶广泛且重叠的 1H NMR 共振信号，阻碍了对低丰度结构基序的可靠分辨和定量 (A. Antonopoulos, Herbreteau, Lafosse, & Helbert, 2004; Tojo & Prado, 2003)。为了克服这些限制，自下而上的糖组学策略得到了越来越多应用，其中卡拉胶被酶解成寡糖，随后通过液相色谱 - 质谱 (LC-MS) 进行分析 (Anastyuk, et al., 2011)。特定的 κ- 和 ι-卡拉胶酶结合 LC-MS/MS 揭示了卡拉胶水解产物中的异质寡糖片段 (Aristotelis Antonopoulos, Favetta, Helbert, & Lafosse, 2005)，而结合离子阱或 Orbitrap MS 的单特异性卡拉胶酶能够实现诊断性 κ- 或 ι-型寡糖的鉴定 (Cao, et al., 2021; Sun, et al., 2014)。最近，高分辨质谱结合多种卡拉胶酶提高了对硫酸化和混合卡拉胶基序的检测 (X. Li, Li, Yao, & Mao, 2025; Mendis, Sasiene, Ropartz, Rogniaux, & Jackson, 2022; Ropartz, et al., 2025)。
尽管现有的糖组学研究已实现了卡拉胶中寡糖的结构鉴定和谱型分析，但 κ- 和 ι-卡拉胶结构单元的定量尚未实现。首先，缺乏结构明确的卡拉胶寡糖标准品限制了大多数分析仅限于相对丰度比较而非定量 (Z. Guo, et al., 2022; Ning, Guo, & Zhu, 2025)。其次，单特异性卡拉胶酶通常无法全面降解含有 κ- 和 ι-型基序的高度混合商业卡拉胶 (Aristotelis Antonopoulos, et al., 2005)。第三，多酶系统可能会增加分析复杂性，因为不同的酶需要不同的反应条件并表现出不同的催化效率。这些限制对于商业 κ- 和 ι-卡拉胶产品尤为重要。如果没有定量定义结构单元的方法，卡拉胶类型、含量和结构异质性的差异就无法准确评估。这种不确定性可能影响下游食品配方、功能评估、结构 - 活性研究和监管质量控制 (Hale, Gerh?user, Gaukel, & Wefers, 2024)。因此，需要一种能够同时释放、鉴定和定量 κ- 和 ι-卡拉胶结构单元的定量糖组学策略。
在我们之前的工作中，鉴定并表征了双功能卡拉胶酶 Cg82Mf [匿名，2007]。该酶水解 κ-卡拉胶中的 G4S→DA 键和 ι-卡拉胶中的 G4S→DA2S 键 (图 S2)，允许 κ-、ι- 和混合结构基序在统一的反应系统中被降解。此外，该酶对测试的其他半乳聚糖（琼脂和紫菜多糖）没有检测到的水解活性 (图 S3)。基于这种酶学基础，本研究开发了一种酶促糖组学策略，用于定量分析 κ- 和 ι-卡拉胶结构单元。通过 UPSEC-HRMS 分析 Cg82Mf 水解的 κ- 和 ι-卡拉胶寡糖，并制备了五种纯化的卡拉胶寡糖标准品以构建校准曲线。然后，将建立的方法应用于 12 种商业卡拉胶添加剂，以定量其结构单元并评估产品异质性。本研究为 κ- 和 ι-卡拉胶的精细结构评估提供了定量分析框架，并为卡拉胶质量评估和标准化提供了方法论支持。
