海参内脏来源的抗冻肽：鉴定、冰重结晶抑制活性及冰结合机制

《Food Research International》：Sea cucumber viscera-derived antifreeze peptides: identification, ice recrystallization inhibition activity, and ice-binding mechanism

　　

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  Alcalase 水解富集了低分子量冷冻保护肽。
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  活性导向分段鉴定出 LMW-II 为关键活性组分。
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  LMW-II 抑制冰重结晶并细化冰晶形态。
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  HPLC-MS/MS 鉴定出 81 种数据库中未报道的候选抗冻肽。
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  模拟表明两亲性肽对冰/水界面具有调节作用。

引言

冷冻储存广泛用于保存水生和其他易腐食品，通过减缓微生物活动和生化劣变。然而，加工、运输和冷链分销过程中的温度波动往往导致重复冻融循环，从而加速冰重结晶和大冰晶的形成。这些变化可能破坏组织结构并导致不良的质量损失，包括蛋白质变性 (Xia et al., 2009)、脂质氧化 (Wang et al., 2021)、质地劣变 (Zhu et al., 2025) 和颜色降解 (Lv & Xie, 2021)。物理方法通常受限于成本和操作要求，而糖和盐等传统冷冻保护剂可能会增加热量负荷和代谢负担 (Bhattacharya, 2018; Ling et al., 2020)。因此，开发天然安全的冷冻保护剂仍然非常理想。

食品来源的抗冻肽因其安全性、可用性和成本效益而成为有吸引力的替代品 (Zhu et al., 2021)。这些肽可以吸附在冰晶表面，从而抑制冰重结晶并延缓冰晶生长，有助于维持冷冻食品系统的结构稳定性。迄今为止，抗冻肽已从各种食品蛋白来源中获得，包括鱼皮 (Raymond & DeVries, 1977) 和虾内脏 (Tan et al., 2025b)。随着对可持续性的日益重视，水产副产品作为生产抗冻肽的有前景原料而受到越来越多的关注。然而，以前的研究主要关注食品系统中的冷冻保护性能，而肽 - 冰和肽 - 水相互作用的分子基础仍了解不足。此外，虽然最近有报道来自海参肠道蛋白水解物的抗冻肽或冷冻保护组分，但对海参内脏来源候选肽的系统鉴定及其冰结合和水网络相关机制的深入阐明仍然有限。

在水产加工副产品中，海参内脏值得特别关注。它们在加工过程中产生大量，往往由于风味复杂、易自溶和处理困难而未被充分利用。海参内脏富含蛋白质，并含有相对高水平的天冬氨酸 (Asp) 和谷氨酸 (Glu) 等酸性氨基酸，这些被认为是抗冻相关活性的重要贡献者 (Lin et al., 2007)。因此，海参内脏是开发功能性抗冻肽的有前景的基质。

因此，本研究旨在开发海参内脏来源的抗冻肽，并从制备到分子机制阐明其抗冻潜力。首先使用抗冻相关指标筛选由不同蛋白酶产生的水解物，以确定最适合的酶处理。然后对活性水解物进行分段和纯化，以富集具有更强冷冻保护和冰重结晶抑制活性的成分。随后，结合 HPLC–MS/MS 与生物信息学分析，对活性最强的组分中的肽进行系统鉴定和筛选。最后，进行分子对接和分子动力学模拟，以研究选定肽与冰晶及周围水分子的相互作用，从而揭示其潜在的冰结合机制。这项工作为海参内脏来源的抗冻肽提供了一条从组分筛选到肽鉴定和分子水平机制阐明的更综合的途径。

章节摘要

材料与化学品

本研究中使用的海参内脏购自瑞达食品有限公司 (河北唐山，中国)。碱性蛋白酶 (2.0 × 10⁵ U/g)、中性蛋白酶 (1.0 × 10⁵ U/g)、风味蛋白酶 (1.5 × 10⁴ U/g) 和胰蛋白酶 (2.5 × 10⁵ U/g) 购自北京索莱宝科技有限公司 (北京，中国)，而木瓜蛋白酶 (8.0 × 10⁵ U/g) 购自上海安谱实验科技股份有限公司 (上海，中国)。Tricine-SDS-PAGE 凝胶试剂盒和过氧化氢酶活性检测试剂盒均为

蛋白酶筛选以制备抗冻活性水解物

SCVP 在各自最佳条件下用五种蛋白酶水解，并通过过氧化氢酶残留活性、THA、DH 和蛋白质转化率评估水解性能 (图 1)。与 BSA 组相比，所有水解物在冻融处理期间对过氧化氢酶显示出冷冻保护效果。经过四个冻融循环后，Alcalase 和 Flavourzyme 水解物提供了更好的保护，残留过氧化氢酶活性分别为 73.16% 和 69.32%，

结论

总之，Alcalase 活性导向水解海参内脏蛋白生成了富含低分子量成分的抗冻肽，进一步分段鉴定出 LMW-II 为关键活性组分。其冷冻保护效果首先表现为重复冻融循环中过氧化氢酶保留率的提高，并直接由其更强的冰重结晶抑制作用支持，如晶粒变粗减少、晶体尺寸和面积减小以及更多

CRediT 作者贡献声明

余瑞成: 写作 - 初稿，可视化，方法论，形式分析，数据整理，概念化。赵阳: 可视化，验证。王林楠: 可视化。葛鹏: 数据整理。张柱鹏: 软件。贾月娟: 调查。马千云: 写作 - 审核与编辑，监督。王文秀: 项目管理，资金获取。孙建峰: 监督，资源，资金获取。

出版同意

不适用。本手稿不包含任何个人数据的任何形式。

伦理批准和参与同意

不适用。本研究不涉及人类参与者、人类数据、人类组织或脊椎动物，因此不需要伦理批准。海参内脏作为加工副产品从一家商业食品公司 (瑞达食品有限公司，河北唐山，中国) 获得。过氧化氢酶和牛血清白蛋白作为商业试剂购买。

生成式 AI 及 AI 辅助技术使用声明

未使用 AI 工具：作者声明在本手稿的准备过程中未使用任何生成式 AI 或 AI 辅助技术。

基金

这项工作得到了 河北省现代农业产业技术体系特海水产品产业深加工与市场开发创新团队建设项目 (HBCT2023220206) 和 国家自然科学基金委员会 (32001732) 的支持。资助方在研究设计、数据收集和分析、发表决策或手稿准备中未发挥作用。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本论文中报告的工作。

致谢

除上述基金来源外不适用。

余瑞成 | 赵阳 | 王林楠 | 葛鹏 | 张柱鹏 | 贾月娟 | 马千云 | 王文秀 | 孙建峰