脉冲电场作为一种促进开菲尔粒生物量生长和开菲尔饮料生产的新颖策略

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Pulsed electric fields as a novel strategy to enhance kefir grain biomass growth and kefir beverage production

　　

摘要脉冲电场（PEF）已成为一项有前途的技术，可用于调节发酵过程中的微生物活性。本研究在发酵前对开菲尔谷粒（KG）进行了低强度 PEF 处理，以刺激生物量增长。采用 Box-Behnken 实验设计评估 PEF 参数（电场强度：1–5 kV/cm，脉冲宽度：8–16 μs，频率：5–15 Hz）对 24 小时发酵后 KG 生物量增长的影响，以及对所得开菲尔饮料（KB）物理化学特性的影响，以未处理的 KG 和 KB 作为参考。使用响应面法确定最佳处理条件。尽管大多数 PEF 处理显著影响了 KG 生物量增长，但在 3 kV/cm、133 个 12 μs 脉冲和 10 Hz 条件下的处理效果最佳，使 KG 生物量增加了 16.59 ± 2.67%，并显著降低了 KB 的 pH 值。扫描电子显微镜显示，经 PEF 处理的 KG 没有明显的结构损伤，尽管观察到蛋白质提取率发生了局部变化。与对照 KB 相比，经 PEF 处理的 KG 所得 KB 表现出更高的总酸度，而总酚含量和抗氧化能力没有观察到显著差异。最后，通过 qPCR 评估的微生物种群显示，用未处理和经 PEF 处理的 KG 制备的开菲尔混合物及其相应的 KB 之间，微生物基因拷贝数没有显著差异。这些结果表明，在 KG 中应用低强度 PEF 可以刺激生物量增长，而不会损害谷粒的结构完整性或 KB 的关键物理化学特性，为 PEF 在 KG 上的应用及其调节复杂共生发酵系统的潜力提供了新见解。

引言开菲尔是一种通过发酵牛奶制成的传统饮料（KB），使用开菲尔谷粒（KG）进行发酵。这些谷粒被认为是一个复杂的微生物群落，由酵母、乳酸菌和醋酸菌组成，嵌入在称为开菲尔多糖的多糖 - 蛋白质基质中（Exarhopoulos 等，2016）。由于其多样化的微生物群落，KB 的消耗与潜在的健康益处有关，包括抗氧化能力、免疫调节和抗菌特性（Bueno-García 等，2021；Vieira 等，2021）。然而，从技术角度来看，KB 的生产具有高过程变异性的特征，这限制了标准化和工业化规模化，因为发酵性能受谷粒来源、微生物组成、发酵条件和谷粒与牛奶比例等因素的影响（Alves 等，2021；Avila-Reyes 等，2022；Bourrie 等，2016；Garrote 等，2001）。

通常，KB 的发酵过程在环境温度（20–30 °C）下进行 18–24 小时，其性能受不同因素的强烈影响，如 KG 的来源、接种物与牛奶的比例以及发酵条件（Alves 等，2021；Avila-Reyes 等，2022）。与使用特定开菲尔发酵剂进行 KB 的商业生产不同，传统的 KB 生产依赖于重复使用 KG 作为发酵接种物。因此，在基于可重复使用 KG 的发酵系统中，维持 KG 的活性和生物量增长在连续发酵周期中尤为重要，其中微生物活性和代谢物产量可能会发生波动（Alves 等，2021；Exarhopoulos 等，2016）。KG 生物量的增加与谷粒活力、重用能力和长期发酵性能的改善有关（Bourrie 等，2016；Farnworth, 2005；Garrote 等，2001）。湿重生物量增加通常被用作 KG 生长和微生物活性的实用指标，反映了发酵过程中微生物增殖和细胞外基质合成的综合效果（Bourrie 等，2016；Garrote 等，2001）。先前的研究试图通过修改发酵条件来增强 KG 生长，包括接种物与牛奶比例、发酵温度、培养基组成以及涉及开菲尔多糖合成的微生物相互作用（Aniguchi 等，2001；Avila-Reyes 等，2022；Bengoa 等，2019；McGovern 等，2024）。然而，旨在通过基于物理能量的过程刺激 KG 生长同时维持或改善发酵性能的策略仍未得到充分评估。迄今为止，Encinas-Vázquez 等（2023）报告了高强度超声波（HIUS）对奶酪乳清开菲尔中 KG 生物量增加的影响。在他们的研究中，HIUS 在 KG 接种前应用于奶酪乳清，导致谷粒生物量和胞外多糖产量的显著增加。尽管这种方法证明了基于物理能量的加工影响 KG 生长的潜力，但关于应用其他新兴技术调节开菲尔发酵的证据仍然有限。

在这种背景下，应用非热强化技术以调节发酵过程中的微生物活性已引起越来越多的关注。其中，脉冲电场（PEF）近年来作为一种辅助发酵过程引起了相当大的兴趣，因为它能够通过可逆电穿孔暂时调节微生物代谢，同时在适当的处理条件下保持细胞活力（Bugarski & Dejmek, 2013；Djuki?-Vukovi? 等，2021；Vaessen 等，2019）。基本上，PEF 涉及将高压放电在短时间（μs）内施加到放置在两个电极之间的产品上（Toepfl 等，2007）。根据 Morales-de la Pe?a 等（2023）的说法，当施加的电场强度（E）在 0.1 到 3 kV/cm 之间时，PEF 处理可归类为低强度 PEF，或者当电场强度高于 3 kV/cm 且高达 15 kV/cm 时，归类为中强度 PEF。这种分类在发酵过程中特别相关，因为低至中强度的 PEF 处理旨在刺激微生物活性而不是灭活微生物。在这些条件下，电穿孔的特征是由外部施加的 E 诱导形成瞬态膜孔。膜渗透性是可逆的还是不可逆的取决于几个处理变量，包括 E、脉冲宽度（τ）、处理时间（t）、脉冲次数（n）、介质的电导率（σ）和细胞特性（Kotnik 等，2019a, Kotnik 等，2019b）。当施加适当的低至中强度 PEF 条件时，膜渗透性通常是可逆的，暂时增加膜渗透性并促进营养运输和代谢物交换，同时允许膜重新封闭并保留微生物活力（Bugarski & Dejmek, 2013；Djuki?-Vukovi? 等，2021；Vaessen 等，2019）。因此，这些处理条件与增强的微生物代谢活性有关，而没有造成不可逆的细胞损伤（Kotnik 等，2019b；Vaessen 等，2019；Yousfi 等，2025）。

最近的研究表明，在不同处理条件下，将 PEF 应用于酸奶发酵剂，如嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus），可以减少发酵时间，改变酸化动力学，并增强微生物的代谢活性，而不会对产品质量产生不利影响（Chanos 等，2020；Miranda-Mejía 等，2024a；Miranda-Mejía 等，2025；Stühmeier-Niehe 等，2023）。这些发现表明，PEF 引起的可逆电穿孔可用于增强发酵系统中的微生物性能。然而，据作者所知，没有研究评估将 PEF 应用于 KG 作为增强生物量增长和 KB 发酵性能的策略。

考虑到 KG 是一个空间结构化基质，其中细菌和酵母嵌入在蛋白质 - 多糖网络中，而不是以游离细胞的形式存在，确定 PEF 辅助发酵过程是否在增强 KG 生长的同时保留这种组织结构，具有重要的科学意义。因此，本研究旨在评估 PEF（1–5 kV/cm）在发酵前对 KG 的影响，以生物量增长为主要标准，通过 Box-Behnken 设计（BBD）确定最佳处理条件。一旦确立了最佳条件，就评估优化后的 PEF 处理对 KG 结构完整性和蛋白质谱的影响，以及所得 KB 的物理化学属性。此外，进行了定量聚合酶链反应（qPCR）分析，以确定 PEF 诱导的生物量增长效应是否与使用 KG 和 KB 制备的开菲尔混合物中微生物种群的变化有关。

章节片段开菲尔谷粒库存的制备标准化 KG 库存，来自商业 KG（RGB，墨西哥），以确保所有实验处理之间的一致性。首先，用无菌水清洗商业 KG 以去除残留牛奶，并使用预先用 70% 乙醇灭菌的筛子过滤。清洗后，立即将 KG 接种到超高温（UHT）牛奶（脂肪含量 2.8%；Alpura，墨西哥）中，比例为 1:2（w/v），并在 24 小时控制的培养箱中允许发酵。

PEF 处理对开菲尔谷粒生物量和发酵相关参数的影响发酵 24 小时后，未处理的 KG（对照）表现出 8.40 ± 1.57% 的生物量增长，这被用作评估 PEF 处理效果的参考值。这一结果在 Avila-Reyes 等（2022）报告的 24 小时发酵后 KG 生物量增长（5–15%）范围内。根据 Chen 等（2021）和 Dong 等（2017）的说法，在开菲尔发酵过程中，会产生一种胞外多糖，有助于颗粒的自聚集，因此存在

结论发酵前对 KG 进行低强度 PEF 处理有效地增强了 24 小时后的生物量增长，而没有损害 KG 的结构完整性或蛋白质谱，也没有损害所得饮料的物理化学特性。通过 RSM 确定的最佳 PEF 条件（3 kV/cm，133 个 12 μs 脉冲，10 Hz，处理时间 1600 μs，比能量输入 4.6 kJ/kg）促进了比更高 PEF 强度更大的生物量增加，表明低强度 PEF 可能刺激

手稿准备过程中生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明在准备本手稿期间，作者使用 ChatGPT（OpenAI, GPT-4, 2025）来润色措辞，提高清晰度，并确保科学内容的结构连贯性。

CRediT 作者贡献声明 Graciela A. Miranda-Mejía：写作 - 审查与编辑，写作 - 初稿，可视化，验证，软件，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。Edgar Bottle：写作 - 审查与编辑，方法论。Elizabeth Sáenz-García：写作 - 审查与编辑，方法论。Gerardo M. Nava：资源，方法论。Viridiana Tejada-Ortigoza：写作 - 审查与编辑，资源。Mariana Morales-de la Pe?a：写作 - 审查与编辑，可视化，

未引用参考文献 Moita, Pedroso and Santos, 2025
Potoroko 等，2018

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致谢 Graciela A. Miranda-Mejía 感谢蒙特雷理工学院和科学、人文学科、技术与创新部（SECIHTI, CVU: 1078348）提供的博士前奖学金。

Graciela A. Miranda-Mejía | Edgar Bottle | Elizabeth Sáenz-García | Gerardo M. Nava | Viridiana Tejada-Ortigoza | Mariana Morales-de la Pe?a
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