引言
牛乳铁蛋白（bLF）是一种铁结合糖蛋白，广泛存在于牛奶和多种体液中（Adlerova et al., 2008; Brock, 2002）。它能够结合并调节铁离子，在铁稳态、免疫调节和抗菌防御中发挥关键作用，因此是先天免疫系统的重要组成部分（Berthon et al., 2022; Hong et al., 2024; Kell et al., 2020; Kim et al., 2025; Legrand, 2012）。临床研究表明，口服bLF比传统铁补充剂更有效，可用于治疗患有炎症性肠病（IBD）的儿童缺铁性贫血。在这些试验中，bLF治疗使血红蛋白水平显著提高，并将胃肠道副作用的发生率从46.2%降至2.5%（El Amrousy et al., 2022）。在乳制品中，bLF的含量直接影响营养价值和产品质量。因此，bLF既被视为功能性蛋白质，也是质量控制指标（Fija?kowski et al., 2025）。因此，开发一种灵敏、稳定、快速的bLF检测方法对于乳制品的质量控制和安全监测至关重要。
目前，bLF的检测方法主要包括高效液相色谱法、生物传感器和基于抗体的免疫学检测方法（Frueh et al., 2024; Oberckal et al., 2023; Rabbani et al., 2024; Shen et al., 2024; Sun et al., 2024）。与物理化学方法相比，酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧向流动免疫测定（LFIA）等免疫学技术具有操作简单、特异性高和检测灵敏度好的优点，成为bLF检测的主流方法（Alhalwani, 2024; Nguyen et al., 2025）。然而，传统的免疫学检测通常依赖单克隆或多克隆抗体，这些抗体的制备周期长、成本高，在温度和化学条件变化下稳定性差，限制了其在快速检测和实际应用中的推广（Liu et al., 2025）。因此，开发具有高亲和力、高稳定性和易于基因工程改造的新分子识别元件已成为当前乳铁蛋白检测领域的重要研究方向（Kim et al., 2023; Sun et al., 2025）。
纳米体（Nb）是来自骆驼科动物重链抗体的可变域（VHH）。它们的分子量约为15 kDa，具有优异的稳定性、溶解性和表达便捷性（Fu et al., 2026; Hamerscasterman et al., 1993; Kim et al., 2023）。与传统抗体相比，纳米体可以识别隐蔽的表位，对温度、pH值和有机溶剂具有较好的耐受性，并可通过基因工程实现标签融合、多聚化和信号增强等功能（Fu et al., 2026; He et al., 2025; Wang et al., 2026; Yong Joon Kim et al., 2023）。近年来，基于纳米体的免疫学检测在食品安全、病原体检测和生物标志物分析方面展现出广泛的应用前景（Chen et al., 2023; Xiao et al., 2024; Zhao et al., 2024）。它们的高稳定性和低成本使其成为构建高灵敏度和可扩展检测平台的理想识别模块。
基于此，本研究以bLF为靶标，利用噬菌体展示技术筛选出特异性结合bLF的纳米体。然后通过将霍乱毒素B亚单位（CTB）的溶解标签融合到纳米体的N端来提高其溶解性，并通过该标签设计实现多聚体结构以增强抗原结合能力（Black et al., 1987; Hussack et al., 2009; Zhang et al., 2004）。随后利用这些纳米体构建了夹心ELISA，实现了bLF的定量检测和快速筛选。本研究不仅为乳铁蛋白的高效检测提供了新的技术解决方案，也为纳米体在蛋白质检测和诊断中的更广泛应用奠定了基础。
章节片段
材料与试剂
本实验使用的噬菌体纳米体文库（2.19 × 10^8 cfu/mL）由研究所的Tu教授提供。大肠杆菌菌株DH5α、Rosetta (DE3)和TG1均保存在实验室中。重组质粒pET25b-Nb27、pET25b-Nb74、pET25b-CTB-Nb27、pET25b-CTB-Nb74和pET25b-CTB均在实验室中构建。
96孔微孔板购自美国的Corning公司；牛血清白蛋白、Tween-20、TMB显色溶液和BSA
纳米体筛选
本研究中，使用bLF作为目标抗原，采用噬菌体展示技术进行了三轮亲和纯化。如图1A所示，噬菌体滴度从1.140 × 10^3 cfu/mL（第一轮）增加到1.099 × 10^6 cfu/mL（第三轮）。回收率逐渐增加，表明有效地富集了特异性结合乳铁蛋白的噬菌体。从第三轮洗脱液中随机选择了118个克隆，并通过噬菌体ELISA进行了筛选，
结论
总之，从噬菌体展示纳米体文库中分离出了两种纳米体Nb27和Nb74，它们能够特异性识别牛乳铁蛋白。这两种纳米体针对不同的、不重叠的表位，可以在夹心ELISA格式中配对使用。将CTB标签融合到纳米体的N端显著增强了检测信号。基于CTB-Nb27（捕获抗体）和Nb74-His（检测抗体）的夹心ELISA检测范围为5–1000 ng/mL，
CRediT作者贡献声明
李超： 数据整理、形式分析、研究、方法学、初稿撰写。 张婷： 数据整理、形式分析、研究、方法学。 李艳萍： 资金获取、方法学、项目管理、审稿与编辑。 何庆华： 项目管理、审稿与编辑。 涂瑞： 项目管理、审稿与编辑。
资金来源
感谢食品科学与资源国家重点实验室、南昌大学（SKLF-ZZA-202513）提供的财政支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
李超 | 张婷 | 李艳萍 | 何庆华 | 涂瑞
