《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Evaluating Antigen–Antibody Interactions: A Comparative Study of Higher-Order Structural MS Methods
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抗体和抗原的表位与互补位的验证对于理解抗体结合至关重要，并且是制药领域关注的焦点。传统上，X射线和核磁共振（NMR）等高分辨率技术用于描绘蛋白质-蛋白质相互作用，但它们容易受到样品制备问题和尺寸限制的影响。基于质谱（MS）的结构分析，如氢/氘交换（HDX）、共
抗体和抗原的表位与互补位的验证对于理解抗体结合至关重要，并且是制药领域关注的焦点。传统上，X射线和核磁共振（NMR）等高分辨率技术用于描绘蛋白质-蛋白质相互作用，但它们容易受到样品制备问题和尺寸限制的影响。基于质谱（MS）的结构分析，如氢/氘交换（HDX）、共价标记和化学交联，相对于传统方法提供了独特的信息和优势。因此，将三种技术并排比较并评估它们的结果在定义感兴趣靶标上的表位方面具有多大的互补性是理想的。在这项研究中，研究人员使用HDX、共价标记和化学交联技术，探测了表皮生长因子受体（EGFR）与西妥昔单抗和扎鲁木单抗的相互作用位点。在共价标记实验中，使用了磺基-NHS乙酸酯和DEPC作为标记试剂。在化学交联实验中，使用了多种交联剂，包括BS3、EDC、DSSO和ADH/DMTMM，以全面搜索蛋白质-蛋白质相互作用。将化学交联和共价标记的结果与HDX以及已知表位进行了比较。共价标记、化学交联和HDX数据显示了EGFR-西妥昔单抗表位的一致结果。对于EGFR-扎鲁木单抗复合物，在合理距离内未发现分子间交联，但从共价标记观察到的表位与HDX一致。结果与已报道的晶体结构一致。总体而言，DEPC和磺基-NHS标记的结果与HDX相当，且周期更快，使其适用于许多分子的快速筛选。与磺基-NHS乙酸酯相比，DEPC标记具有更高的残基覆盖率，但面临更快速水解和更复杂修饰等独特挑战。研究人员进一步将共价标记实验的应用扩展到细胞环境中，使用相同的模型系统，结果与纯化蛋白一致，使得共价标记成为一种直接从细胞中筛选复杂靶标和受体表位的合适方法。
**论文解读：基于高级结构质谱方法的抗原-抗体相互作用评估：一项比较研究**
**1. 研究背景、问题与意义**
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是药物发现的核心，它们揭示了抗原上可以被选择性靶向的区域。抗体的作用机制由其识别的表位所定义，表位结构上的细微差异都可能改变靶标结合。因此，早期、准确的表位表征对于指导抗体设计和优先选择候选药物至关重要。传统上，高分辨率技术如X射线晶体学、冷冻电镜（cryo-EM）和核磁共振（NMR）被用于结构表征和研究PPI，但这些技术复杂、不适用于早期对多个分子进行结构解析，且需要昂贵的设备。基于质谱（MS）的技术，如氢/氘交换质谱（HDX-MS）、共价标记和化学交联质谱（XL-MS），虽然分辨率较低，但能提供独特的结构信息，可与高分辨率技术结合，以进一步理解大型复合物的动态和组装。MS技术具有试剂需求量低、样品制备简单、耐受翻译后修饰以及在发现过程中能更早地研究多个候选分子等优势。先前的研究已经证明了结合两种或多种基于MS的结构技术进行表位和互补位作图的价值，例如配对使用HDX-MS与XL-MS，以及HDX-MS与共价标记。然而，尚未有报道对HDX-MS、共价标记和XL-MS这三种方法同时应用于同一抗体-抗原复合物进行系统比较。此外，先前的比较研究仅限于纯化蛋白系统，并未扩展到直接在细胞环境中的蛋白质上研究抗体结合相互作用。本研究通过使用两种临床相关的靶向EGFR的抗体作为模型系统，填补了这两个空白，直接评估了每种技术用于药物表位作图的相对分辨率、通量和互补性，并进一步证明了共价标记在完整细胞中进行相互作用研究的适用性。该论文发表在《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》。
**2. 关键技术方法概述**
本研究主要运用了三种基于质谱（MS）的高级结构分析技术：氢/氘交换质谱（HDX-MS）、共价标记和化学交联质谱（XL-MS）。HDX-MS通过监测主链酰胺的氘代水平变化来识别保护区域。共价标记使用磺基-NHS乙酸酯和焦碳酸二乙酯（DEPC）两种试剂，不可逆地修饰溶剂可及的氨基酸侧链。化学交联则使用BS3、EDC、DSSO和ADH/DMTMM四种不同化学性质的交联剂，以捕获蛋白质间邻近信息。研究以全长表皮生长因子受体（EGFR）胞外域（ECD）与两种治疗性抗体（西妥昔单抗和扎鲁木单抗）的复合物为模型系统，并进一步将共价标记方法应用于稳定过表达EGFR的HEK293T细胞中。
**3. 研究结果**
**化学交联质谱（Cross-Linking MS）**
通过使用BS3、EDC、DSSO和ADH/DMTMM四种交联剂，研究人员对EGFR与西妥昔单抗和扎鲁木单抗的结合界面进行了研究。对于EGFR-西妥昔单抗复合物，鉴定出5个独特的分子间交联，其中包括EGFR的Lys463与轻链（LC）的Lys49，以及Ser474与LC的Asp1，这些交联距离与已知的晶体结构（PDB: 1YY9）一致，且位于已知的表位区域内。另有三个涉及西妥昔单抗Fc区域的分子间交联，被归因于反应过程中EGFR的瞬时二聚化，而非表位信息。对于EGFR-扎鲁木单抗复合物，仅获得两个分子间交联，且一个指向Fc区域，另一个因EDC反应条件对EGFR构象的潜在影响而不可靠，因此未能提供有效的表位信息。结果表明，BS3产生的交联数量最多，而DSSO提供了更明确的碎片谱图，但交联技术的信息性依赖于界面处反应性残基的存在。
**共价标记（Covalent Labeling）**
使用磺基-NHS乙酸酯和DEPC两种试剂对EGFR-抗体复合物进行标记。对于EGFR-西妥昔单抗复合物，两种标记试剂均鉴定出多个标记程度显著降低的残基，其中Lys443和Lys465在两种标记反应中均表现出显著降低，且与已知的晶体结构表位一致。DEPC标记的残基覆盖范围（77个残基）大于磺基-NHS乙酸酯（49个残基），提供了更丰富的相互作用界面信息。对于EGFR-扎鲁木单抗复合物，共价标记数据预测其表位集中在EGFR结构域III的Lys443-Lys465区域，其中Lys443、Lys454、Lys463和Lys465的标记显著降低，与先前的突变研究结果一致。
**HDX-MS**
HDX-MS结果显示，当EGFR与西妥昔单抗结合时，在五个不同区域（残基350-355、357-370、394-399、430-443和461-476）观察到氘摄取显著降低，这些区域与已知的晶体结构表位高度吻合。对于EGFR-扎鲁木单抗复合物，观察到残基430-443、444-456和457-476区域的氘摄取降低，与通过突变研究定义的扎鲁木单抗表位（包括Lys443、Lys465、Met467和Ser468）相一致。
**三种技术比较**
综合比较，对于EGFR-西妥昔单抗复合物，三种MS技术的结果高度一致，均成功鉴定了已知表位中的关键残基（如Lys463、Lys465）。对于EGFR-扎鲁木单抗复合物，虽然XL-MS未能提供有效表位信息，但共价标记和HDX-MS的结果相互印证，共同指向了Lys443-Lys465这一核心区域。HDX-MS提供了最高的分辨率，能全面反映相互作用表面的变化。共价标记分辨率较低，但由于其周期快、仪器要求简单，适用于快速筛选和细胞环境下的研究。XL-MS则作为补充工具，用于确认直接的物理接触。
**细胞环境中的共价标记**
研究人员将共价标记实验成功应用于过表达EGFR的HEK293T细胞中。在细胞环境中，磺基-NHS乙酸酯标记结果与纯化蛋白实验一致，鉴定了Lys443、Lys463和Lys465等关键表位残基。DEPC标记结果也基本一致，但DEPC穿透细胞膜标记了胞内结构域残基。总体而言，在完整细胞中进行的共价标记实验成功捕获了EGFR的主要表位残基，结果与纯化蛋白实验高度一致，展示了该方法在更接近生理条件下研究抗体相互作用的潜力。
**4. 总结与讨论**
本研究将三种基于MS的结构分析技术——HDX-MS、共价标记和XL-MS，应用于EGFR-西妥昔单抗和EGFR-扎鲁木单抗复合物。结果表明，即使对于产生较少化学交联和共价标记数据的EGFR-扎鲁木单抗复合物，三种技术的结果与X射线晶体学结果之间也显示出整体一致性。HDX-MS在绘制相互作用表面方面显示出最高的分辨率，因此在需要利用纯化蛋白进行高分辨率表位作图时是推荐方法。共价标记受限于特定侧链的可用性和反应性，相对于HDX-MS分辨率较低；然而，它提供了最快的周期，最少的仪器要求，以及能够在完整细胞中研究生理条件下抗体相互作用的适用性。当需要确认两种蛋白之间的直接物理接触时，推荐将化学交联作为HDX-MS和结构数据的补充方法，需注意其信息性取决于结合界面上是否存在适当位置的反应性残基。
**结论（翻译）**：三种MS结构分析技术被应用于EGFR-西妥昔单抗和EGFR-扎鲁木单抗复合物。两个蛋白复合物的结果揭示了化学交联、共价标记、HDX-MS和X射线晶体学之间的整体一致性，尽管EGFR-扎鲁木单抗复合物产生的化学交联和共价标记数据较少。HDX-MS在绘制相互作用表面方面显示出最高的分辨率，当需要使用纯化蛋白进行高分辨率表位作图时是推荐方法。共价标记受限于相对于HDX-MS的特定侧链的可用性和反应性，导致分辨率较低；然而，它提供了最快的周期，最少的仪器要求，以及能够在完整细胞中研究生理条件下抗体相互作用的适用性。当需要确认两种蛋白之间的直接物理接触时，推荐将化学交联作为HDX-MS和结构数据的补充方法，需注意其信息性取决于结合界面上是否存在适当位置的反应性残基。使用同位素标记的可裂解交联剂，可以产生具有确定质量差的未标记/标记肽对，从而减少假阳性鉴定，代表了本研究未采用的方法学进步，并作为未来工作的一个方向被提及。
