《Journal of Agriculture and Food Research》：Impacts of delayed sealing on aerobic stability of corn silage inoculated with Lentilactobacillus buchneri and L. hilgardii: insights from volatilomics and metagenomics
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传统上，接种异型发酵乳酸菌（LAB）的玉米青贮有氧稳定性的改善被归因于乙酸的产生，但所涉及的机制可能超出乙酸产生。延迟密封对微生物群落动态、挥发性有机化合物（VOC）产生和有氧稳定性的综合影响仍知之甚少。本研究评估了密封时间（立即密封对比24小时延迟密封）和两
传统上，接种异型发酵乳酸菌（LAB）的玉米青贮有氧稳定性的改善被归因于乙酸的产生，但所涉及的机制可能超出乙酸产生。延迟密封对微生物群落动态、挥发性有机化合物（VOC）产生和有氧稳定性的综合影响仍知之甚少。本研究评估了密封时间（立即密封对比24小时延迟密封）和两种商业布氏乳杆菌（Lentilactobacillus buchneri）与希氏乳杆菌（L. hilgardii）混合接种剂对全株玉米青贮的发酵特性、营养值、微生物群落、VOC谱和有氧稳定性的影响。延迟密封显著影响了青贮保存。密封前暴露于氧气使青贮温度升高高达14°C，增加了干物质损失，耗尽了水溶性碳水化合物，并通过积累脂氧合酶衍生化合物、短链醇、有机酸、酯和芳香代谢物显著改变了挥发物谱。尽管可发酵底物减少，乳酸发酵仍占主导地位，且延迟密封的青贮在开窖后表现出数值上更高的有氧稳定性。基于扩增子的微生物组分析揭示，延迟密封主要改变了真菌群落结构，解释了观察到的39%的方差，并促进了假丝酵母属（Candida）和纳凯酵母属（Nakaseomyces）等属。相比之下，异型发酵LAB接种主要通过富集特定的乳杆菌属（Lactobacillus）扩增子序列变体（ASV）并减少包括魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、沙雷氏菌属（Serratia）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）成员在内的分类群来影响细菌群落。这些微生物变化伴随着较低的酵母数量、改善的纤维消化率和数值上更高的有氧稳定性。值得注意的是，乙酸浓度与有氧稳定性并无严格关联，而多种VOC与稳定性显著相关，这表明挥发性代谢物对青贮保存的贡献超出了传统上归因于乙酸的作用。这些发现表明，玉米青贮有氧稳定性受底物可用性、微生物演替和挥发性代谢物产生的共同调控。定量挥发组学与基于扩增子的微生物组分析的整合为青贮保存提供了新的机制见解，并为优化密封管理和商业异型发酵LAB接种剂的应用提供了有价值的框架。
**论文解读：延迟密封与异型发酵乳酸菌接种对玉米青贮有氧稳定性的影响——基于挥发组学与宏基因组学的整合分析**
**研究背景**
青贮过程中，快速填充、压实和密封是减少干物质（DM）损失、促进高效乳酸发酵的关键。然而，收割或装窖时的操作限制可能导致密封前氧气暴露时间延长，从而激活植物呼吸和好氧微生物代谢，增加干物质损失并消耗水溶性碳水化合物（WSC）。自20世纪90年代末以来，异型发酵乳酸菌（LAB）如布氏乳杆菌（Lentilactobacillus buchneri）和希氏乳杆菌（L. hilgardii）被广泛用作青贮接种剂，因为它们能通过将乳酸降解为乙酸和1,2-丙二醇来提高有氧稳定性。然而，近年研究发现，乙酸本身并不能完全解释观察到的有氧稳定性增强，其他代谢物可能也参与其中。同时，延迟密封对有氧稳定性的影响存在矛盾报道：一些研究发现适度延迟密封反而提高了有氧稳定性，其机制尚不清楚。因此，有必要整合定量挥发组学（volatilomics）和扩增子微生物组分析（metagenomics），系统评估密封管理（立即密封 vs. 24小时延迟密封）与两种商业异型发酵LAB接种剂对玉米青贮发酵特性、微生物群落、挥发物谱及有氧稳定性的综合影响，并揭示其潜在机制。该研究由意大利都灵大学（University of Turin）农业、森林与食品科学系（DISAFA）的研究人员完成，论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。
**研究内容与结论**
研究人员开展了为期100天的实验室青贮试验，采用全株玉米（杂交种P1547，播种于意大利北部波河平原典型Udifluvent土壤，密度75,000粒/公顷），在约50%乳线期收割，干物质含量约34.2%。试验设置5个田间区组作为重复，每个区组分为3个堆，分别进行不接种（CONT）、接种商业混合接种剂LAB1（Magniva Platinum 1）和LAB2（Magniva Platinum Whole Crop，均含布氏乳杆菌和希氏乳杆菌）。每堆约11 kg新鲜物料装入20 L高密度聚乙烯（HDPE）实验室青贮窖，一半立即密封（IMMEDIATE），另一半在24小时后密封（DELAYED），于20±1°C条件下保存100天后开窖分析。研究得出以下主要结论：24小时延迟密封显著改变了青贮生化和微生物途径，导致干物质损失增加、WSC耗尽、酵母和肠杆菌数量升高，但意外地提高了开窖后的有氧稳定性；乙酸浓度与有氧稳定性无显著相关，而酵母数量与有氧稳定性呈强负相关；多种VOC（如乙偶姻、糠醛、己酸等）与有氧稳定性显著相关，提示挥发物在抑制腐败中起补充作用；延迟密封主要改变了真菌群落结构（解释了39%的方差），促进了假丝酵母属（Candida）和纳凯酵母属（Nakaseomyces）的生长，而接种则主要影响细菌群落，富集了特定乳杆菌ASV并减少了魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）等。该研究首次整合定量挥发组学和扩增子微生物组分析，为理解青贮保存机制提供了新见解，并为优化密封管理和接种策略提供了有价值的框架。论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。
**主要关键技术方法**
研究人员在意大利都灵大学实验农场（44°53'N, 7°41'E，海拔232 m）种植玉米，收割后按区组随机分配处理。关键技术包括：1）多重顶空固相微萃取（MHS-SPME）结合全二维气相色谱-质谱/火焰离子化检测器（GC×GC-MS/FID）进行定量挥发组学分析，注释并定量了98种挥发性有机化合物（VOC）；2）基于扩增子测序的微生物组分析，分别扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区和真菌ITS2区，在Illumina MiSeq平台进行双端250 bp测序，使用QIIME2和DADA2生成扩增子序列变体（ASV），并基于UNITE和SILVA数据库进行分类注释；3）传统培养方法测定乳酸菌、酵母、霉菌、乙酸菌和肠杆菌数量；4）线性混合模型和PERMANOVA等统计方法分析密封时间、接种剂及其交互作用对发酵参数、微生物群落和VOC的影响。
**研究结果**
**3.1 密封前饲草特性**
通过分析密封前青贮原料的化学、发酵和微生物特征（表1），发现延迟密封24小时显著改变了饲草特性：与立即密封相比，延迟密封处理温度升高约14°C（36°C vs. 22°C），酵母、肠杆菌和乳酸菌数量增加约1.5 log cfu/g，pH降低（4.74 vs. 5.61），WSC含量降低（P＜0.001），并检测到微量乳酸、乙酸和乙醇，表明好氧阶段已启动微生物代谢。
**3.2 开窖后青贮特性**
开窖后分析（表2）显示，延迟密封导致pH和乙醇含量升高，干物质损失显著增加（立即密封平均1.83%，延迟密封平均3.86%）。酵母数量在接种青贮中数值降低至约3.5 log cfu/g，对照约4.5 log cfu/g。乳酸和乙酸含量在密封时间或接种处理间无显著差异。回归分析（图2）表明，酵母数量与有氧稳定性呈负相关（P＜0.001，R2=0.53），而乙酸含量与有氧稳定性无显著相关（P=0.604，R2=0.01）。延迟密封青贮在数值上表现出更高的有氧稳定性。此外，LAB2接种提高了中性洗涤纤维30小时消化率（D-NDF
30h）和7小时淀粉体外消化率（IVSD
7-o）。
**3.3 青贮挥发性有机化合物**
通过MHS-SPME和GC×GC-MS/FID准确量化了98种VOC（表3），涵盖醇、酯、醛、酮、有机酸、烃和芳香化合物。延迟密封是最强的影响因素，使63种化合物（64.3%）在两种密封条件下显著差异，其中77.8%的酸、63.0%的醇、80.0%的酯受到影响。与有氧稳定性的Pearson相关性分析（图4）显示，乙偶姻（r=-0.58）、己酸（r=-0.38）和糠醛（r=-0.39）与有氧稳定性呈最强负相关。接种剂仅显著影响7种化合物，表明其对VOC组成的影响有限。
**3.4 青贮宏基因组**
**3.4.1 细菌群落**：16S测序分析显示，α多样性在密封时间或接种处理间无显著差异。β多样性分析表明，LAB接种显著影响细菌群落组成（补充表2），而密封延迟无显著影响。乳杆菌属（Lactobacillus）在所有青贮中占主导（>70%），但ASV水平分析显示，两种接种剂均富集了多个乳杆菌ASV，同时减少了其他ASV，并降低了魏斯氏菌属、明串珠菌属、沙雷氏菌属和肠杆菌科成员的相对丰度（补充表4）。延迟密封仅影响少数细菌ASV。
**3.4.2 真菌群落**：ITS测序分析表明，α多样性无显著差异。β多样性分析显示，延迟密封和接种均显著影响真菌群落组成（补充表5），但主坐标分析（PCoA）揭示真菌群落主要按密封时间而非接种组织（补充图4）。延迟密封与假丝酵母属（Candida）、库氏酵母属（Kurtzmaniella）和纳凯酵母属（Nakaseomyces）呈正相关，而立即密封与卡氏酵母属（Kazachstania）和毕赤酵母属（Pichia）相关。差异丰度分析（补充表7）确认密封延迟是真菌群落变化的主要驱动因素，增加了多种酵母的丰度，减少了丝状真菌。
**讨论与结论**
讨论部分指出，立即密封仍是减少干物质损失和保存营养的推荐管理实践，但24小时短时延迟密封并不一定损害发酵质量，甚至可能通过消耗残余底物而提高有氧稳定性。然而，更长时间的延迟应避免，因为会显著增加营养损失。研究还强调，乙酸浓度不能单独解释有氧稳定性差异，有氧稳定性是底物可用性、微生物群落和多种挥发物代谢物相互作用的结果。研究人员建议，挥发组学与宏基因组学的整合为开发同时改善饲料质量、保存效率和有氧稳定性的管理和接种策略提供了有价值的框架。结论部分翻译如下：
**结论：** 本研究表明，24小时延迟密封深刻影响了玉米青贮的生化和微生物途径。密封前暴露于氧气刺激了植物呼吸和好氧微生物活性，导致干物质损失增加、水溶性碳水化合物耗尽、发酵模式改变以及微生物群落结构和挥发性代谢物产生的显著变化。尽管延迟密封对干物质回收和一些营养性状产生负面影响，但它意外地使开窖后有氧稳定性数值提高。延迟密封后观察到的有氧稳定性改善，加上乙酸浓度与有氧稳定性之间的有限关系，表明青贮保存受底物可用性、微生物演替和挥发性代谢物之间相互作用调控，而非单一发酵产物。挥发组学与基于扩增子的微生物组方法的整合应用为这些机制提供了互补见解，凸显了其在青贮研究中的价值。因此，挥发组学与宏基因组学的联合使用代表了制定旨在同时改善饲料质量、保存效率和有氧稳定性的管理和接种策略的有价值框架。
