《Journal of Chromatography A》：A multi-criteria Gradient Score workflow for RP-HPLC-MS/MS method development: from column selection to segmented gradient optimization for targeted phenolic profiling
编辑推荐：
•扩展的梯度评分工作流程用于 RP-HPLC–MS/MS 方法开发。•色谱和定时 MRM 采集标准的综合评估。•用于比较色谱柱和梯度曲线的多标准策略。•保留建模支持合理的分段梯度设计。•适用于食品基质中靶向酚类分析的工作流程。引言基于多反应监测 (MRM) 的靶向 LC–MS
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扩展的梯度评分工作流程用于 RP-HPLC–MS/MS 方法开发。
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色谱和定时 MRM 采集标准的综合评估。
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用于比较色谱柱和梯度曲线的多标准策略。
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保留建模支持合理的分段梯度设计。
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适用于食品基质中靶向酚类分析的工作流程。
引言
基于多反应监测 (MRM) 的靶向 LC–MS/MS 方法已成为测定食品和植物来源基质中酚类化合物的既定分析工具。它们的流行源于高灵敏度、选择性和定量能力的结合，能够在一个色谱运行中同时分析数十种化学多样的分析物 [[1], [2], [3], [4]]。然而，随着目标化合物数量的增加，色谱分离和 MS/MS 采集变得越来越相互依赖，使得方法开发变得更加具有挑战性 [[5], [6], [7]]。在广泛的酚类化合物组中，化合物在极性、酸性、疏水性和离子化行为上存在显著差异，而许多位置异构体产生相同的前体离子或产物离子 [1,8,9]。共洗脱、峰展宽、MRM 检测窗口过度重叠以及总分析时间都可能影响最终方法的实际性能。此外，分析物在色谱图上的非均匀分布可能进一步阻碍方法开发，导致可用的分离空间利用效率低下。因此，即使色谱系统能提供几种关键化合物的出色分离，如果大多数分析物在狭窄的保留间隔内洗脱或定时过渡的过度重叠损害了 MS/MS 采集，该系统仍可能是低效的 [[10], [11], [12]]。
靶向 LC–MS/MS 的方法开发本质上是一个多标准优化问题，需要同时考虑色谱选择性、分析物分布、采集约束和分析时间。许多色谱优化策略仍然依赖于有限的性能描述符，通常关注色谱分辨率或分析时间。虽然这些标准单独使用很有用，但它们很少提供对色谱性能的综合描述，并且在同时比较多种固定相、梯度曲线和分析物时，可能导致不同甚至矛盾的排名结果 [12,13]。此外，与定时 MRM 方法相关的采集约束，包括保留时间窗口、驻留时间和循环时间限制，引入了额外的权衡，这些权衡通常与色谱优化分开考虑 [14]。
为解决 LC-MS/MS 方法开发的挑战，人们提出了各种色谱优化策略，从经验的试错方法到实验设计、保留建模和计算机辅助方法开发 [[15], [16], [17], [18], [19]]。在这些方法中，基于线性溶剂强度 (LSS) 理论的保留建模已成为最常用的工具之一，因为它能够在一系列梯度条件下预测保留行为，同时大幅减少所需的实验数量 [[20], [21], [22], [23], [24]]。然而，保留建模本身并没有定义一个统一的决策标准，用于比较替代固定相或选择最合适的梯度曲线，尤其是在必须同时考虑多个色谱和采集相关目标时。因此，一种能够整合色谱和采集相关信息的客观且可配置评估策略，可以大幅提高 LC–MS/MS 方法开发的透明度和可重复性。这种方法不应取代色谱解释；相反，它应该提供一个合理的框架，用于在必须同时考虑多个优化目标时比较替代固定相和梯度曲线 [25]。
在本研究中，我们扩展了先前介绍的梯度评分 (GS) 概念 [26,27]，结合了峰宽、分析物分布和关键对分离的额外色谱描述符，以及对定时 MRM 窗口重叠的细化描述。筛选了 10 种反相固定相，使用标准化梯度条件，并根据 GS 进行排名。随后使用选定的固定相基于 LSS 理论进行保留建模，并设计旨在改善分析物在整个色谱运行中分布的分段梯度。最后，所得方法应用于代表性食品基质（包括果汁、茶、葡萄酒和醋）中 65 种广泛酚类化合物的同时分析，以证明其在实际样品中的适用性。
章节摘要
材料与试剂
LC–MS 级乙腈 (Honeywell, Charlotte, NC, USA)、LC–MS 级乙酸 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 和使用 Milli-Q 纯化系统 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 产生的去离子水被用作流动相的组分。LC–MS 级甲醇 (Honeywell, Charlotte, NC, USA) 被用于制备酚类化合物的储备液。
酚类化合物的分析标准品购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。所有
固定相的多标准评估
选择适当的固定相是开发大型分析物组靶向 LC–MS/MS 方法中最关键的步骤之一。对于广泛的酚类数据集，色谱柱性能不能由单个色谱参数充分描述。因此，调查的固定相首先使用一组互补的子标准进行表征，描述关键对分离、峰宽、分析物分布、检测窗口重叠以及 的洗脱时间
结论
本研究展示了一种扩展的梯度评分工作流程，用于客观的 RP-HPLC–MS/MS 方法开发，应用于靶向酚类分析。该方法将色谱和采集相关描述符整合到一个可配置的多标准框架中，能够同时评估关键对分辨率、峰宽、分析物分布、定时 MRM 窗口重叠和分析时间。
应用于固定相筛选确定了 Raptor ARC-18 色谱柱为最
CRediT 作者贡献声明
Michal Ka?par: 写作 – 初稿，方法论，调查，形式分析，数据管理，概念化。 Pavlína Musilová: 调查，数据管理。 Soňa ?ezková: 调查，数据管理。 Petr ?esla: 写作 – 审查与编辑，监督，资金获取。
竞争利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为影响了本论文中报告的工作。
致谢
P.C. 感谢捷克科学基金会的财务支持，项目 No. 22-09556S。
Michal Ka?par|Pavlína Musilová|Soňa ?ezková|Petr ?esla
