聚乙烯在耐冷红球菌属菌株中的转化：基于转录组学与13C-同位素示踪的评估

《Journal of Hazardous Materials》：Polyethylene transformation by a psychrotolerant Rhodococcus strain assessed by transcriptomics and 13C-isotope tracing

　　

摘要
聚乙烯正日益在自然界中累积，包括北极等偏远地区。尽管非生物过程能够在原位使聚乙烯碎裂，但微生物介导的生物转化被认为确实发生。然而，所涉及的酶与代谢途径仍未得到充分解析。在本研究中，研究人员利用内部构建的寒冷环境微生物库，通过PlasticDB数据库进行基于基因组的（in silico）筛选，并采用基于荧光的方法进行体内（in vivo）筛选（in silico），以寻找具有聚乙烯降解潜力的细菌。通过转录组学与蛋白质组学分析，在候选菌株中鉴定编码可能具有聚乙烯降解能力的胞外酶的基因，研究人员筛选出一株红球菌（Rhodococcus erythropolis）及其两种酶：一个假定蛋白（Hypr1）和一个脂肪酶家族蛋白（Lip2）。将候选基因在埃希氏菌（Escherichia coli）中异源表达，在基于荧光的聚乙烯转化检测中获得了阳性结果。研究人员应用¹³C标记的聚乙烯评估和估算聚乙烯转化及碳同化，结果发现R. erythropolis以及未转化的和重组E. coli均在70天后对初始添加的聚乙烯产生了胞外转化。此外，未转化的E. coli和R. erythropolis将少量但显著的聚乙烯来源碳转化为二氧化碳。¹³C标记同样被追踪至R. erythropolis的细菌生物量中。总体而言，本研究结果为未经预处理聚乙烯的生物转化提供了证据，并提出一个假定蛋白和一个脂肪酶家族蛋白是两种与聚乙烯转化相关的新型候选酶。

**聚乙烯微生物转化研究：来自寒冷环境的耐冷红球菌候选酶鉴定与¹³C-同位素示踪验证**

**1. 研究背景与科学问题**
全球塑料产量持续增长，2024年已达到4.31亿公吨，其中26%为聚乙烯。由于聚乙烯具有极高的化学稳定性和抗降解能力，它已成为全球范围内最持久且含量最丰富的塑料污染物之一。尽管聚乙烯高度顽固，其表面仍可为微生物定殖提供生态位，形成所谓的“塑料圈”。在包括高山和北极在内的陆地寒冷环境中，塑料圈群落的物种组成和功能潜力因聚合物类型和环境条件而异。然而，微生物在低温条件下转化聚乙烯的机制仍然很不明确。

目前，微生物对合成聚合物的转化作为一种减少塑料持久性的潜在策略受到越来越多的关注。培养依赖的方法已鉴定出大量塑料相关微生物，而组学和计算方法的发展则使得从微生物基因组、宏基因组、转录组和蛋白质组中发现候选聚合物活性酶成为可能。与含有可水解键的聚合物相比，聚乙烯仍然是最难被微生物转化的底物之一。已报道的聚乙烯降解研究存在诸多混杂因素，例如使用含添加剂的聚乙烯、紫外线照射或化学氧化等预处理手段，以及缺乏对所提出机制的遗传学或生物化学验证。尽管已有大量微生物被报道与聚乙烯转化相关，但只有少数候选蛋白被研究，包括烷烃单加氧酶、漆酶、谷胱甘肽过氧化物酶和脂肪酶等。然而，这些蛋白质在聚乙烯转化中的具体贡献仍悬而未决，微生物同化聚乙烯来源碳的直接证据依然十分有限。

完整的聚乙烯生物降解需要多个协同步骤：聚合物修饰、可及转化产物的形成、这些产物的摄取，以及它们进入细胞代谢或矿化途径。使用¹³C标记聚乙烯的稳定同位素方法为追踪微生物转化过程中聚乙烯来源碳提供了宝贵证据，但已有研究尚未鉴定出相关的酶和途径，并且单个候选蛋白是否足以支持聚乙烯来源碳的利用仍不清楚。寒冷陆地环境代表了微生物多样性和新型聚合物活性蛋白的一个尚未充分开发的宝库。生活在这些环境中的微生物可能拥有适应低温条件的酶活性，这为理解微生物聚合物转化提供了新的资源。一个包含超过1500株分离自寒冷陆地环境的微生物菌株库此前已被建立，其中部分分离株已针对聚乳酸和聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯等生物塑料的降解进行了研究，但它们对聚乙烯转化的潜在作用仍是未知的。

**2. 研究目标与技术方法概述**
本研究旨在从寒冷陆地环境中鉴定与聚乙烯转化相关的耐冷细菌分离株和候选蛋白。研究人员通过综合运用基因组筛选、功能检测、转录组学、蛋白质组学、异源表达以及¹³C标记聚乙烯实验来研究微生物与聚乙烯的相互作用。研究试图回答以下问题：（i）冷适应细菌分离株是否含有与聚乙烯转化相关的基因组潜力；（ii）选定的分离株是否表现出聚乙烯相关转化活性；（iii）转录组学和蛋白质组学分析能否鉴定出参与聚乙烯相互作用的候选蛋白；（iv）异源表达是否支持所选候选蛋白在聚乙烯转化中的作用；（v）¹³C标记聚乙烯能否评估细菌分离株对聚乙烯来源碳的转化。

本研究采用的主要关键技术方法包括：（1）基于PlasticDB数据库的基因组（in silico）筛选，对来自微生物库的约1200株细菌分离物（由208个参考基因组代表）进行聚乙烯转化相关基因的同源检索；（2）基于4-甲基伞形酮月桂酸酯（4-MUL）嵌入聚乙烯涂层的96孔板荧光检测体系，对264株细菌分离株进行聚乙烯相关转化活性的快速筛选；（3）对候选菌株Rhodococcus erythropolis 1149进行14天聚乙烯暴露培养后的转录组测序（RNA-seq）和基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学分析，鉴定显著上调且编码预测胞外蛋白的基因；（4）将候选基因克隆至pMAL-p5g载体并在Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中异源表达，再利用荧光检测验证其聚乙烯转化活性；（5）使用99原子%¹³C标记的聚乙烯（¹³C-PE）作为唯一碳源进行70天培养实验，结合同位素比例质谱仪（IRMS）测定顶空气体中¹³C标记的CO₂、培养上清液和细菌生物量中的¹³C富集量，以量化聚乙烯来源碳的转化和同化。菌株来源包括瑞士穆奥塔达巴尔巴佩德和瓦尔拉维伦的活动层土壤、格陵兰北部维卢姆研究站北站的塑料膜，以及来自斯瓦尔巴群岛和法兰士约瑟夫地群岛的塑料废弃物。

**3. 主要研究结果**
**3.1 基因组（in silico）筛选结果**
利用PlasticDB对生物库中约1200株细菌分离物（以208个参考基因组为代表）进行筛选。该数据库列出了三种与聚乙烯转化相关的基因和酶：漆酶、烷烃-1-单加氧酶和烷烃羟化酶。结果显示，116株分离物至少含有一个与已报道聚乙烯转化基因序列一致性≥30%的基因。漆酶基因最为普遍：90个基因组编码与聚乙烯转化漆酶相似的基因，其中60个基因组中这是唯一检测到的聚乙烯转化相关基因。编码烷烃-1-单加氧酶和烷烃羟化酶的基因相对较少，分别出现在56个和22个基因组中。76个参考基因组仅含一个聚乙烯转化相关基因，28个含两个，12个基因组编码了全部三种聚乙烯转化相关基因。基因组筛选进一步表明，黄杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属和诺卡氏菌属的参考基因组中广泛存在与聚乙烯转化相关基因相似的基因。

**3.2 基于荧光检测的聚乙烯转化潜力评估**
基于基因组筛选结果，研究人员选择了264株细菌分离物进行荧光检测实验。其中73株分离物显示出聚乙烯相关转化的证据。在这些分离物中，39株可能至少含有一个与聚乙烯转化基因相似的基因，12株不含此类基因（另有7株因缺乏参考基因组和15株菌混合物未分类）。具有聚乙烯解聚能力的分离物属于37个不同的细菌物种和15个菌混合物，其中8个含有Rhodococcus erythropolis。在荧光检测中表现最突出的菌株属于诺卡氏菌科，27株被测分离物中有16株具有聚乙烯解聚能力。假单胞菌属和莫拉菌科的分离株也表现出相对较高的聚乙烯转化潜力。

**3.3 聚乙烯存在下编码预测胞外蛋白的上调基因**
研究人员从27株被测诺卡氏菌科菌株中选择了Rhodococcus erythropolis 1149（RE-1149）作为候选菌株进行转录组分析，因为该菌株生长迅速且在荧光检测中表现持续强劲。基于聚乙烯转化候选蛋白应在胞外发挥作用的假设，研究人员重点关注编码胞外蛋白的基因。在聚乙烯存在条件下培养14天后，与对照组相比，RE-1149中有54个基因显著上调和61个基因显著下调。在上调基因中，有7个基因被预测编码胞外蛋白：三个假定蛋白（hypr1、hypr2、hypr3）、两个脂肪酶家族蛋白（lip1、lip2）、一个HAD-IB家族磷酸酶（HAD-IB）。此外，一个膜结合的烷烃-1-单加氧酶基因（alk1m）也显著上调。alk1m基因与来自类芽孢杆菌属菌株DK1的聚乙烯相关烷烃单加氧酶具有59.4%的序列一致性，与来自假单胞菌属菌株E4的烷烃羟化酶具有44.1%的一致性。值得注意的是，虽然在参考基因组中鉴定到漆酶类似基因，但在聚乙烯补充条件下，两个漆酶样基因的转录水平很低（平均每样本<4个读数），表明这些基因在实验条件下并未显著表达。

**3.4 蛋白质组中上调基因编码的胞外蛋白**
为验证候选基因不仅在转录水平表达，也确实被翻译成蛋白质，研究人员进行了蛋白质组学分析。由于该蛋白质组数据集主要是为候选鉴定而非定量差异蛋白质组学而生成，因此未进行蛋白丰度差异的统计学检验。总体而言，RE-1149中上调基因编码的胞外蛋白在蛋白质组中含量稀少或缺失。对应于hypr1、hypr2、hypr3、lip2和HAD-IB的肽段在对照组和聚乙烯处理组中均被检测到，而对应于lip1和alk1m的肽段低于检测限。基于胞外定位预测、转录组和蛋白质组水平的双重检测以及与聚合物转化的潜在相关性，研究人员进一步选择了假定蛋白1（hypr1）、脂肪酶家族蛋白2（lip2）和烷烃-1-单加氧酶（alk1m）进行功能表征，将合成的基因插入pMAL-p5g质粒中。

**3.5 异源表达验证假定蛋白和脂肪酶的聚乙烯解聚活性**
候选基因hypr1、lip2和alk1m分别在E. coli BL21(DE3)pLysS中异源表达，得到菌株Ec-Mhypr1、Ec-Mlip2和Ec-Malk1m。选择这三个候选基因是因为它们代表了互补的蛋白质类别：（i）一个先前未表征的假定蛋白（Hypr1），（ii）一个先前与聚合物转化相关的脂肪酶家族蛋白（Lip2），以及（iii）一个频繁被涉及在聚乙烯转化中的候选酶烷烃单加氧酶。在异源表达后的荧光检测中，Ec-Mhypr1和Ec-Mlip2表现出显著升高的聚乙烯相关转化活性，10小时后4-MU的平均释放量分别为0.38 μM和0.29 μM。相比之下，对照菌株Ec-BL21未检测到聚乙烯相关转化活性，而Ec-Malk1m的活性无统计学显著升高。

**3.6 ¹³C标记聚乙烯的胞外转化与碳同化验证**
为评估聚乙烯来源碳的矿化，研究人员测量了顶空CO₂中的¹³C_ex。在培养早期，所有生物样品的δ¹³C-CO₂值反映了葡萄糖代谢，但RE-1149的葡萄糖利用出现延迟。在第21天之前，所有菌株的聚乙烯处理组和生物对照组的δ¹³C-CO₂值随时间变化相似。70天后，RE-1149（-11.4‰）和Ec-BL21（-13.6‰）的聚乙烯处理组中δ¹³C-CO₂值显著高于各自的对照组，对应Δ¹³C_ex值分别为0.71 ng和1.82 ng。这些数据表明，RE-1149和Ec-BL21对初始添加聚乙烯的年代谢率分别约为0.002%和0.005%。在70天后，Ec-BL21、RE-1149、Ec-Mhypr1和Ec-Mlip2的培养上清液δ¹³C值从-21.8‰增加到16.6‰，对应70天后¹³C_ex积累量为105.9 ng至193.8 ng。在细菌生物量方面，70天后RE-1149的生物量δ¹³C值为-20.4‰，Ec-BL21为-23.2‰。仅RE-1149相对于其生物对照组（-22.5‰）表现出显著的¹³C富集，对应于平均9.07 ng的Δ¹³C_ex被纳入RE-1149生物量中。总体而言，这些结果证明所有测试菌株均对¹³C-PE产生了胞外聚乙烯相关转化。Ec-BL21的聚乙烯相关转化活性因表达来自RE-1149的假定蛋白hypr1或脂肪酶lip2而增强，对应初始添加聚乙烯的年平均聚乙烯相关转化率为0.001%–0.003%。

**4. 讨论与结论**
本研究开发了一种结合基因组筛选、功能检测、异源表达和同位素示踪的综合方法，用于研究来自寒冷陆地环境的耐冷微生物。该策略从Rhodococcus erythropolis RE-1149中鉴定出两种与聚乙烯转化相关的候选蛋白——假定蛋白（Hypr1）和脂肪酶家族蛋白（Lip2），且该转化发生在无化学预处理条件下。RE-1149为研究低温下微生物与聚乙烯的相互作用提供了一个模型系统，因为该菌株来源于受冻土影响土壤的活动层，且此前已被证明可定殖于塑料薄膜。同位素示踪进一步为实验室条件下未经预处理聚乙烯来源碳的有限转化提供了证据。然而，目前的数据尚未确定直接的聚乙烯C–C键断裂，也未阐明Hypr1和Lip2是直接作用于聚乙烯、氧化性聚合物相关化合物，还是通过增加聚合物可及性间接发挥作用。极低的转化率和未解决的聚合物修饰与产物形成机制表明，Hypr1和Lip2应被视为聚乙烯转化的候选组分，而非确定的聚乙烯降解酶。

在讨论中，研究人员对研究结果进行了多方面的深入分析。关于冷适应微生物的聚乙烯转化遗传潜力，荧光检测作为一种快速功能筛选工具，鉴定了生物库中的细菌分离株和异源表达蛋白表现出可能与聚合物转化相关的胞外水解活性。尽管4-MUL检测提供了一种灵敏且高通量的水解酶活性检测方法，但它并不直接评估聚乙烯C–C主链的断裂，因此阳性荧光信号应被解释为酶学潜力的指示，而非聚乙烯解聚的直接证据。红球菌属在候选聚乙烯转化菌株中的富集与该属对疏水性化合物（包括长链烃和芳香分子）的广泛代谢多功能性一致。然而，基因组中先前与烃或聚合物转化相关基因的存在并不能证明其功能上参与了聚乙烯转化，基于基因组的预测应被视为定向功能验证的基础而非聚乙烯降解能力的直接证据。

关于聚乙烯转化相关候选蛋白，异源表达鉴定出假定蛋白（Hypr1）和脂肪酶家族蛋白（Lip2）是在测试条件下与聚乙烯转化相关的候选蛋白，而烷烃单加氧酶候选蛋白未表现出可检测的活性。这一观察与此前对与聚乙烯相关的Rhodococcus ruber的转录组学和脂质组学研究一致，该研究中也未检测到烷烃单加氧酶的表达。这些发现共同表明，聚乙烯转化可能涉及多种酶途径，可能依赖于酶的组合、辅助蛋白或序贯反应，而非单一的催化步骤。对Lip2潜在作用的解释需要谨慎：由于聚乙烯缺乏酯键，经典的脂肪酶介导水解无法解释聚合物主链的直接断裂。相反，Lip2可能作用于聚合物老化或转化过程中产生的氧化官能团、靶向少量氧化组分，或通过间接机制增强聚合物可及性。同样，Hypr1缺乏注释的功能结构域，无法可靠预测其生化功能。因此，需要进一步的生物化学和结构学研究来确定这些蛋白质是否直接与聚乙烯相互作用、修饰聚合物相关化合物，或通过间接的胞外机制发挥作用。

关于聚乙烯来源碳转化的证据和局限性，本研究的同位素示踪证明了未经预处理聚乙烯中一部分碳被转化为CO₂，并将聚乙烯来源碳掺入微生物生物量相关库中。升高的δ¹³C-CO₂水平仅在70天后才被检测到，表明未经处理聚乙烯来源碳的转化非常缓慢，可能涉及较长的滞后期。未经处理的聚乙烯来源碳转化为CO₂的计算转化率极低（RE-1149为每年0.002%），大大低于报道的经紫外线处理¹³C-PE与Rhodococcus ruber共同培养的转化率（1.24%）。这种差异可能反映了氧化聚乙烯具有更高的可及性，其中非生物氧化引入了含氧基团，从而促进了后续的微生物转化。一个主要的局限性是未能确定胞外聚乙烯来源转化产物的化学特性，因此聚合物修饰、可溶性中间产物形成、细胞摄取和胞内代谢之间的关系仍未得到解决。此外，本研究使用的聚乙烯底物是一种未经预处理的低分子量材料，与环境塑料废弃物中常见的高分子量聚乙烯不同。尽管该底物为微生物筛选提供了受控系统，但未来需要使用环境相关聚乙烯材料进行进一步验证，以评估这些发现在更广泛环境背景下的相关性和适用性。

本研究通过综合基因组筛选、功能检测、异源表达和同位素示踪，研究了来自寒冷陆地环境的耐冷微生物对聚乙烯转化的潜力。研究人员鉴定出细菌候选菌株和来自Rhodococcus erythropolis RE-1149的两种蛋白Hypr1和Lip2与聚乙烯转化相关，并证明了实验室条件下未经预处理聚乙烯来源碳的有限转化。这些发现凸显了冷适应微生物作为识别与持久性聚合物相互作用蛋白潜在候选物的宝贵资源，同时也证明在未经预处理条件下聚乙烯来源碳的转化是缓慢且有限的。Hypr1和Lip2因此代表了需要进一步研究的候选对象，而非已确定的聚乙烯降解酶。未来结合纯化蛋白检测、结构和生化表征、转化产物的化学鉴定以及遗传验证的研究，对于阐明聚乙烯转化的机制和途径以及限制微生物利用聚乙烯来源碳的因素至关重要。总体而言，本研究为探索聚合物相互作用蛋白和潜在的低温柔性聚乙烯转化生物催化剂奠定了基础。

该论文发表在《Journal of Hazardous Materials》期刊上，研究得到了瑞士联邦森林、雪与景观研究所（WSL）的支持，作者包括Anja Werz、Ivano Brunner、Weihong Qi、Matthias Saurer、Marco M. Lehmann、Jan Kühnel、Beat Stierli和Beat Frey。