与 OsCd1 同源的基因，命名为 ABNORMAL SHOOT IN YOUTH（OsASY），在水稻中作为镉内流转运蛋白发挥作用

《Journal of Hazardous Materials》：The gene homologous to OsCd1, designated as ABNORMAL SHOOT IN YOUTH ( OsASY), functions as a cadmium influx transporter in rice

　　

摘要
水稻中的镉（Cd）污染威胁着粮食安全和公众健康。鉴定和表征控制镉吸收和转运的关键基因对于培育低镉品种至关重要。在本研究中，我们表征了一个镉响应的主要促渗体超家族（MFS）成员，即青年异常苗（ABNORMAL SHOOT IN YOUTH, OsASY），该成员与已知的镉转运蛋白 OsCd1 具有高度的序列同源性。功能分析表明，OsASY 定位于质膜，并作为介导镉吸收和转运的内流转运蛋白发挥作用。OsASY 在水稻中组成型表达，其转录本和蛋白质水平均被镉胁迫下调。OsASY 功能缺失显著降低了水稻中的镉积累并增强了镉耐受性，而过表达则产生了相反的效果。通过在酵母中异源表达和使用 osasy 突变体进行镉动力学测定，证实了 OsASY 的镉内流活性。OsASY 功能的改变可能通过直接或间接影响其他镉响应基因的表达来触发次级调控效应。值得注意的是，OsASY 与 OsCd1 相互作用，两者在酵母中共表达可增加细胞内镉浓度。综上所述，这些发现表明 OsASY 作为一种膜定位转运蛋白，正向调控镉积累。此外，我们的初步证据表明，对 OsASY 的靶向编辑提供了一项有前景的策略，可在不影响主要农艺性状或产量的情况下降低籽粒镉含量，突显了其作为培育低镉积累水稻品种分子靶标的潜力。

引言
镉（Cd）是一种高毒性重金属，被公认为是全球最危险的无机污染物之一。由于其具有强的环境迁移性、高持久性、显著的生物有效性以及在植物中易于吸收和积累的特性，镉对农业安全和公众健康构成了严重威胁 [1]。水稻（Oryza sativa L.）作为全球近 50% 人口的主要饮食碳水化合物来源，与其他谷物作物相比，表现出更高的镉吸收倾向，这种差异归因于镉吸收转运蛋白的表达水平、转运活性及组织特异性定位的变化 [2], [3]。因此，水稻中的镉污染已成为危及全球粮食安全的关键问题。为了减轻水稻籽粒中过量镉积累的风险，研究人员探索了多种策略，主要包括环境调控（土壤修复和农艺优化）和遗传改良（低镉积累品种育种），还包括诸如多倍体育种结合纳米材料等前沿协同技术 [4], [5]。其中，由于经济可行性和可持续性，遗传改良和低镉水稻品种的开发引起了广泛关注 [6], [7], [8]。因此，鉴定和表征控制水稻籽粒镉积累的关键基因，对于培育低镉品种和保障粮食安全具有重要的理论和应用价值。

镉从土壤到水稻根系并最终在籽粒中积累的转运过程是一个复杂的生理过程，涉及多种细胞、组织和器官的协调作用。该过程中的一个关键步骤是跨细胞膜的共质体运输，这依赖于膜定位的转运蛋白 [9]。然而，迄今为止尚未鉴定出镉特异性转运蛋白；大多数已知的与镉吸收相关的转运蛋白也参与其他二价阳离子的吸收和转运。例如，水稻中天然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）家族的成员 OsNRAMP5 和 OsNRAMP1 已被确定为介导根系镉吸收的关键转运蛋白 [10], [11]；然而，它们也参与锰（Mn）的吸收和转运。这些基因的功能缺失有效地减少了镉积累，但损害了锰的吸收，这对正常的植物生长和籽粒发育产生了不利影响，特别是在缺锰条件下 [10], [11], [12]。同样，铁调节转运蛋白（IRT）家族的成员，包括 OsIRT1/2 [13]，以及多个 ZRT-IRT 样蛋白（ZIP）家族成员，如 OsZIP7 [14]、OsZIP5 和 OsZIP9 [15]，据报道在不同程度上参与了根系镉吸收和转运，然而它们也参与包括铁（Fe）和锌（Zn）在内的必需微量元素的转运。这些局限性限制了已知基因资源在育种项目中的应用。此外，目前对水稻镉胁迫响应的理解仍不完整；已表征的转运蛋白不足以完全阐明体内镉吸收、转运和积累的全过程，许多潜在的调控因子尚未被探索。因此，迫切需要系统地探索参与镉积累的新基因或转运蛋白，以更全面地了解水稻镉胁迫响应调控网络。

主要促渗体超家族（MFS）是已知植物中最大的膜转运蛋白家族之一。MFS 成员介导多种底物的跨膜运输，广泛参与植物生长、发育和胁迫响应 [16]。然而，植物 MFS 转运蛋白的功能表征仍然相对有限。大多数功能已表征的植物 MFS 成员被认为参与糖、低聚肽和硝酸盐等营养物质的转运 [17], [18]，只有少数研究暗示了更广泛的生理作用。例如，拟南芥 MFS 成员 ZIF1（锌诱导促渗体 1）已被确定为定位在液泡膜上的锌耐受性调节因子，在维持锌和铁稳态方面发挥积极作用 [19], [20]。另一种液泡转运蛋白 ZIF2 通过促进金属在根系中的固定来赋予锌耐受性，从而减少向地上部的转运 [21]。ZIFL1（锌诱导促渗体样 1）是 ZIF1 的旁系同源物，在维持锌和铁稳态方面与 ZIF1 部分重叠，但表现出较低的转运活性；此外，ZIFL1 在生长素转运和干旱胁迫响应中具有双重功能 [22], [23], [24]。拟南芥中的 ZIFL2 作为铯（Cs）和钾（K）转运的调控成分发挥作用 [25]。在水稻中，ZIFL 亚家族成员 OsZIFL4 和 OsZIFL5 已被证明参与植物铁载体分泌 [26]。值得注意的是，尽管 MFS 家族在植物营养转运和重金属稳态中发挥重要作用，但关于其参与镉胁迫响应的研究仍然非常有限。迄今为止，OsCd1 是水稻中唯一已鉴定的 MFS 家族镉转运蛋白；它作为定位在根质膜上的次级主动转运蛋白发挥作用，其功能缺失显著减少了镉吸收和籽粒镉积累。此外，OsCd1 中的错义突变 Val449Asp 代表了籼稻和粳稻品种间籽粒镉含量差异的关键遗传决定因素 [27]。

在本研究中，我们鉴定了另一个 MFS 基因，即青年异常苗（ABNORMAL SHOOT IN YOUTH, OsASY; LOC_Os10g37520），该基因与 OsCd1 具有显著的同源性。我们发现，在镉胁迫下，OsASY 在转录和蛋白质水平上均显著下调，并且该基因可能对镉有强烈响应。OsASY 功能缺失突变体表现出增强的镉耐受性和减少的镉积累；相反，过表达系显示出增加的镉敏感性和升高的镉积累，表明 OsASY 正向调节水稻中的镉积累。亚细胞定位显示 OsASY 靶向质膜，为其作为转运蛋白的功能提供了关键的细胞学证据。此外，利用酵母中的异源表达和水稻中的镉内流测定，我们证实 OsASY 具有镉转运活性，并且其功能改变可能通过调节其他镉转运蛋白的表达来触发次级调控效应，从而协同调节镉积累。值得注意的是，OsCd1 的转录水平受 OsASY 正向影响，且这两种蛋白质相互作用。两者在酵母中共表达导致镉吸收增加。本研究扩展了植物 MFS 家族的功能景观，为水稻镉积累的分子机制提供了新的见解，并建议将 OsASY 作为培育低镉积累品种的潜在遗传靶标。

章节片段
水稻同源基因的进化分析
在之前的研究中，我们的小组对约 1,000 份水稻资源的镉积累进行了全基因组关联研究（GWAS），并鉴定出多个与镉含量显著相关的数量性状位点（QTLs）。基于水稻参考基因组和公共数据库（Gramene 和水稻数据中心）对相关 QTL 区间进行功能注释，揭示了一个主要促渗体超家族（MFS）转运蛋白基因，即青年异常苗（OsASY; LOC_Os10g37520）

OsASY 的序列和进化分析
OsASY 的整个开放阅读框（ORF）已成功扩增，随后利用源自公开可访问基因组数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/）的参考序列数据进行克隆。克隆序列与数据库条目完全一致。OsASY 基因在结构上由八个外显子和七个内含子组成，编码一个由 456 个氨基酸组成的蛋白质（图 S1）。使用 AlphaFold 数据库（https://alphafold.com/），我们预测了

讨论
减少水稻中的镉积累是粮食安全和公众健康面临的主要长期挑战。挖掘新的镉响应基因，阐明其作用机制，随后筛选和培育高产、低镉积累水稻品种，是减轻镉污染的稳定、高效且具成本效益的策略。MFS 和 ATP 结合盒转运蛋白（ABC）超家族构成了植物中已知的两个最大的膜转运蛋白家族。

结论
在本研究中，我们鉴定出 OsASY 为参与水稻镉吸收和积累的 MFS 转运蛋白家族的功能成员。OsASY 与已知的镉转运蛋白 OsCd1 具有高度同源性，并具有直接的镉内流活性。它与 OsCd1 发生物理相互作用，且在酵母中共表达这两种蛋白质可增加细胞内镉积累。遗传证据表明，OsASY 正向调控水稻中的镉积累，因为其敲除显著减少了镉积累和

环境意义
在本研究中，我们鉴定水稻（Oryza sativa）基因 OsASY 为参与镉吸收的关键因子。OsASY 与 OsCd1 具有高度同源性，并作为镉内流转运蛋白发挥作用。OsASY 的敲除显著减少了水稻中的镉吸收和积累。重要的是，初步证据表明 OsASY 功能的丧失不会损害其他必需微量元素的吸收，从而有效地减少了籽粒镉含量，而不损害农艺性状或产量。

未引用参考文献
[44]

资助
本研究得到了国家自然科学基金（32472059）、国家自然科学基金（项目编号 42020104004）、土壤科学研究所（ISSA）田间前沿项目（SIP2215）、国家红土壤改良工程技术研究中心（编号 2025NETRCRSI-1）、农业农村部长江中下游作物生态生理与农作系统重点实验室的支持。

CRediT 作者贡献声明
沈仁芳：监督、获取资助、概念化。陈昌兆：可视化、方法论、数据整理。郑璐：调查。陈金：方法论、调查、概念化。关先娇：验证、概念化。王道波：验证、调查、数据整理。任明阳：验证、调查。涂春燕：写作 - 原稿、可视化、验证、方法论、调查、形式分析、数据整理、概念化。黄伟

利益冲突声明
作者声明，他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本论文中报告的工作。

涂春燕 | 黄伟 | 王道波 | 任明阳 | 陈金 | 关先娇 | 陈昌兆 | 郑璐 | 沈仁芳 | 朱晓芳
中国科学院南京土壤研究所，国家土壤与可持续农业重点实验室，南京，211135，中国