聚乙烯微塑料毒性的单细胞视角：关联成纤维细胞重编程与肺部免疫微环境改变

《Journal of Hazardous Materials》：A Single-Cell Perspective on Polyethylene Microplastic Toxicity: Linking Fibroblast Reprogramming to Immune Microenvironment Alterations in the Lung

　　

摘要
背景
微塑料是普遍存在且持久性环境污染物，越来越多的证据表明它们在人体组织（包括肺部）中积累。慢性肺部暴露与组织损伤、纤维化重塑和免疫失调有关；然而，对于潜在的多种细胞动力学和转录改变的系统性理解仍然有限。聚乙烯是空气中微塑料的主要成分，但其在肺部中的特定致病机制尚不清楚。
方法
我们建立了一个聚乙烯微塑料（PE-MPs）慢性鼻内暴露的大鼠模型。对暴露组和对照组动物的肺组织进行组织病理学分析，并进行高通量单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。采用计算流程构建综合细胞图谱，表征转录组改变，推断细胞通讯，并绘制转录因子调控网络。基于经典标志物对细胞群进行注释，并通过差异分析比较 PE-MPs 暴露组和对照组。
结果
组织学分析显示，PE-MPs 暴露的肺中胶原沉积增强，血管周围淋巴细胞浸润。对 25,625 个细胞进行的 scRNA-seq 分析描绘了一个重塑的细胞景观，其特征是成纤维细胞和肌成纤维细胞扩展，同时 T 细胞、B 细胞和树突状细胞比例增加，伴随着特定上皮和内皮亚群的收缩。成纤维细胞表现出活化表型，特征是细胞外基质基因上调，推断 TGF-β 通路转导子 Smad3 和 Smad4 过度活化。上皮功能障碍在各群体中明显：克拉拉细胞显示分化潜力改变，纤毛细胞显示纤毛发生受损，II 型肺泡细胞下调表面活性剂稳态基因。髓系免疫细胞上调趋化因子（Cxcl9, Cxcl10, Ccl3, Ccl4）和 MHC 分子，表明抗原呈递能力和趋化活性增强。值得注意的是，浆细胞样树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和 NK/NKT 细胞中的 Tgfb1 表达显著升高。配体 - 受体相互作用分析预测 TGF-β1 对成纤维细胞的信号传导增强，以及通过趋化因子介导的免疫细胞招募增加，特别是浆细胞样树突状细胞。CD123、TGF?β1 和 p?Smad3 免疫反应性与马松三色染色的胶原沉积在小肺动脉的血管周围空间中共定位。
结论
本研究提供了高分辨率的单细胞转录组图谱，描绘了慢性 PE-MPs 暴露的肺部反应。我们确定了一个协调的致病网络，涉及上皮/内皮功能障碍、免疫微环境失衡以及通过旁分泌 TGF-β 信号传导的成纤维细胞活化，作为驱动微塑料诱导肺损伤的核心机制。这些发现阐明了将环境塑料暴露与肺纤维化和免疫失调联系起来的新的细胞和分子途径，为治疗干预提供了潜在靶点。

引言
微塑料，定义为直径小于 5 毫米的塑料颗粒，由聚合物基质结合功能性添加剂和各种化合物组成 [1]。它们主要通过较大塑料碎片的环境降解产生。由于其广泛的生产、广泛的使用以及对生物降解的高抗性，其环境积累速率远超分解速率，导致其在生态系统中普遍存在 [2], [3]。这些颗粒已被记录在水、食品和空气中，通过摄入、吸入和皮肤接触进入人体 [4]。最近的报告检测到微塑料存在于多种人体组织和器官中，包括肺、胎盘、肝、肾、脑和骨骼系统 [5], [6], [7], [8]。其中，作为气体交换关键器官的肺部尤为令人关注。我们研究小组此前在慢性阻塞性肺病（COPD）患者的痰液样本中鉴定出微塑料颗粒 [9]。此外，在中国五个主要城市的环境监测确定聚乙烯是最常见的空气传播微塑料类型 [10]，促使我们调查其特定的肺部毒性。
不断积累的实验证据表明，微塑料对呼吸系统产生多种细胞毒性作用。体外暴露于聚苯乙烯颗粒会降低肺泡上皮细胞活力，诱导 S 期细胞周期阻滞，激活炎症基因转录，并改变与细胞周期和凋亡相关的蛋白表达，这些效应随着暴露浓度增加而增强 [11]。吸入聚苯乙烯微塑料通过激活氧化应激和 Wnt/β-catenin 信号通路在小鼠中诱导肺纤维化 [12]。小鼠肺部暴露于多壁碳纳米管（MWCNTs）会抑制 T 细胞依赖性抗体反应；这种抑制是由肺组织中升高的转化生长因子-β (TGF-β) 介导的，甚至可能影响脾脏免疫功能 [13]。PS-NPs 可通过增强上皮 - 成纤维细胞和巨噬细胞 - 成纤维细胞之间的相互作用来增加细胞内铁含量，从而促进成纤维细胞活化和肺纤维化 [14]。综上所述，这些研究表明微塑料可以通过免疫失调、氧化应激和上皮损伤破坏肺部稳态，从而可能驱动纤维化进展。
肺纤维化的病理特征为肺泡上皮损伤、肌成纤维细胞增殖和细胞外基质过度沉积。作为细胞外基质的主要生产者的成纤维细胞，通过关键信号通路被激活，其中 TGF-β 发挥核心作用 [15]。免疫微环境失衡——由单核细胞和巨噬细胞活性改变驱动——可通过细胞因子网络进一步加剧成纤维细胞活化，形成持续炎症和病理性组织重塑的恶性循环 [16]。然而，微塑料通过协调的多种细胞相互作用扰乱肺部稳态的精确机制尚未完全定义。
单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）的最新进展提供了高分辨率能力，可以剖析复杂组织微环境中的细胞异质性和细胞间通讯。与 bulk 转录组学不同，scRNA-seq 能够识别稀有细胞亚群，重建动态分化轨迹，并在单细胞分辨率下绘制配体 - 受体信号网络。例如，scRNA?seq 已用于揭示微塑料暴露后斑马鱼肠道免疫和分泌功能的改变，以及肠道微生物群组成的变化 [17]。然而，目前缺乏对微塑料对哺乳动物肺组织影响的系统单细胞分析。
以前的研究表明，微塑料暴露使用组织学、免疫组织化学和 bulk 转录组学诱导肺部炎症和纤维化。然而，这些研究很大程度上依赖于全组织或单一细胞类型分析，无法解析免疫和基质区室之间复杂的细胞间相互作用。在这里，我们采用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）在单细胞分辨率下系统剖析聚乙烯微塑料（PE-MPs）暴露后肺部生态系统的重塑，重点关注成纤维细胞重编程与免疫微环境改变之间的潜在联系。该数据集为理解微塑料暴露下肺部的病理生理学提供了新资源，并可能揭示未来治疗干预的潜在靶点。

部分片段
大鼠模型
Sprague–Dawley (SD) 大鼠 (n = 8, 雄/雌 4/4; 体重 200–220 g) 购自广东省医学实验动物中心（中国广东）。动物被随机分配至对照组 (n = 4, 雄/雌 2/2) 或聚乙烯微塑料（PE-MPs）暴露组 (n = 4, 雄/雌 2/2)。所有大鼠饲养在特定病原体-free (SPF) 条件下，环境温度 22 ± 2 °C，相对湿度 50 ± 10%，光照周期 12 小时
PE-MPs 暴露重塑大鼠肺的单细胞转录组景观
为了评估 PE-MPs 对肺组织的影响，建立了 PE-MPs 暴露的大鼠模型。对外周肺组织进行组织学检查和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）（Fig. 1A）。在图中，PE?MPs?暴露组标记为 'Treated'。苏木精 - 伊红（H&E）和马松三色染色显示，与 PE-MPs 暴露的肺相比，小血管周围有明显的淋巴细胞浸润，以及增强的胶原纤维组织

讨论
许多研究表明，人类通过吸入和饮食摄入暴露于微塑料并摄入微塑料，随后微塑料颗粒在各种人体组织中被检测到 [4], [5], [6], [7], [8]。值得注意的是，在中国五个主要城市进行的空气传播微塑料环境调查发现聚乙烯是最常见的塑料类型 [10]。因此，我们选择聚乙烯微塑料（PE-MPs）作为模型材料来调查其

结论
PE-MPs 慢性暴露诱导大鼠肺多维分子和病理改变，其特征为呼吸上皮和血管内皮细胞功能受损，肺部免疫微环境失衡状态，以及免疫细胞与成纤维细胞之间显著增强的细胞相互作用。具体而言，免疫细胞——特别是浆细胞样树突状细胞（pDCs）——似乎在促进 TGF-β 激活中起关键作用。

环境意义
慢性吸入聚乙烯微塑料重塑肺部生态系统：激活纤维化信号，诱导上皮和血管功能障碍，并通过 T 细胞耗竭和 NK 细胞下调驱动免疫抑制。趋化因子上调促进淋巴浸润和支气管相关淋巴组织新生。这些发现表明微塑料并非惰性——它们损害组织完整性和免疫监视，增加感染和

伦理批准
研究设计获得了汕头大学医学院动物实验伦理批准（No.SUMC2022-519)。

利益冲突
作者声明无竞争利益。

作者贡献
Xiaoxuan Fan: 进行动物干预实验和组织病理学分析，分析解释数据，创建可视化，起草手稿。Jingtian Liu: 分析解释数据，并创建可视化。Shumin Huang: 进行动物干预实验和组织病理学分析。Xu Wang: 分析解释数据，并创建可视化。Tianming Liu: 进行动物干预实验和组织病理学分析。

资助
本研究部分由广东省研究生教育创新计划 (2023SFKC_032) 资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有作用。

CRediT 作者贡献声明
Xu Wang: 方法论，可视化。Tianming Liu: 调查。Xiaochen Ma: 数据整理，可视化。Xiaoxuan Fan: 形式分析，方法论，可视化，写作 – 原始草稿。Jingtian Liu: 形式分析，可视化。Shumin Huang: 调查，数据整理。Jiayi Zhou: 软件，可视化。Pi Guo: 概念化，资金获取，写作 – 原始草稿，写作 – 审查与编辑。Yinge Wu: 监督，概念化，方法论，项目管理。

利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本论文报告的工作。

Xiaoxuan Fan|Jingtian Liu|Shumin Huang|Xu Wang|Tianming Liu|Xiaochen Ma|Jiayi Zhou|Pi Guo|Yinge Wu
汕头大学医学院第一附属医院检验科，广东汕头，中国