《Environmental DNA》：Long-Read Metabarcoding With Optimized Bioinformatic Analysis Outperforms Short-Read Metabarcoding for Assessing Soil Protist Diversity and Ecology
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宏条形码是评估各种生态系统微生物群落组成的强大工具。它包括对标记基因的扩增，随后进行高通量测序和生物信息学分析以识别物种。第二代测序通过允许对短DNA片段进行高通量测序，使生物多样性研究得以普及。长读长测序现在允许使用更长的标记，潜在地提供改进的分类学分辨率。
宏条形码是评估各种生态系统微生物群落组成的强大工具。它包括对标记基因的扩增，随后进行高通量测序和生物信息学分析以识别物种。第二代测序通过允许对短DNA片段进行高通量测序，使生物多样性研究得以普及。长读长测序现在允许使用更长的标记，潜在地提供改进的分类学分辨率。直到最近，这一优势还部分被长读长测序较高的错误率所抵消。研究人员在此证明，使用当前的牛津纳米孔技术测序（Kit V14化学试剂和R10.4.1流动池）结合适当的分析流程，测序错误对长读长宏条形码的准确性影响微乎其微。使用从两种原生生物培养物中提取的DNA，研究人员估计使用18S rRNA基因的长读长宏条形码在属水平上的单条长读长分类学错误分配在0%到0.01%之间，而仅依赖V4区的短读长Illumina宏条形码在0%到0.01%之间。研究人员还提出了一种优化的长读长聚类程序，该程序结合了按质量对读长进行预排序。当应用于相同的培养物时，它产生了更少但更大的序列簇，并增加了与参考序列的平均相似度。应用于从26个葡萄园土壤样本中提取的环境DNA时，与短读长宏条形码相比，该方法识别出原生生物群落与环境变量之间更强的相关性。值得注意的是，单条长读长的分类学分配（不进行聚类）进一步提高了对环境模式的敏感性。这些结果支持了长读长宏条形码的可靠性，并突出了其在生态学研究中的巨大潜力。更广泛地采用这种方法可能会提高生物多样性评估的准确性，反过来，未来的研究将受益于公共数据库中长序列的扩展表示。
宏条形码是扩增和高通量测序标记基因的技术，已成为生物多样性评估的核心方法。第二代测序技术允许高通量测序短DNA片段，但其分类学分辨率不足以区分近缘物种。第三代测序技术如PacBio和牛津纳米孔技术（ONT）允许对长标记进行测序，提高了分类学分辨率，但早期较高的测序错误率限制了其应用。随着化学试剂的改进，ONT的错误率已接近Illumina，且具有成本低、便携的优点。然而，目前仍不清楚测序错误如何影响ONT长读长宏条形码的分类学和多样性评估可靠性，且缺乏标准化的分析流程。在土壤生态系统中，原生生物在微生物捕食、初级生产、有机物降解和致病性等方面发挥关键作用，但其多样性和生态作用仍相对未被充分探索。因此，研究人员开展了这项研究，旨在评估基于核糖体操纵子的ONT长读长宏条形码（使用R10.4.1化学试剂）在表征土壤原生生物群落方面的可靠性和相关性，并与常用的短读长Illumina宏条形码（靶向18S rRNA基因的V4区）进行比较。研究表明，长读长宏条形码提供了与短读长相当的准确性，但在生态模式检测上表现更优。这项研究发表在《Environmental DNA》上，对提高生物多样性评估的准确性具有重要意义，并突出了长读长宏条形码在生态学研究中的巨大潜力。
研究评估了两种宏条形码方法。第一种是短读长Illumina宏条形码，扩增18S rRNA基因的V4区（约450 bp）并进行Illumina测序。第二种是长读长ONT宏条形码，扩增核糖体操纵子（从18S-V4到28S-D9，约4500 bp）并进行ONT测序。样本队列来源包括2个原生生物培养物（Chromochloris zofingiensis和Apusomonas proboscidea）和26个来自瑞士Valais州和瑞士高原的葡萄园土壤样本。生物信息学分析包括使用BARRNAP选择18S序列，使用VSEARCH进行质量过滤和聚类，以及使用VSEARCH usearch_global和PR2 v5.1.0数据库进行分类学分配。对于长读长数据，研究人员比较了聚类和直接读长分配两种分析流程。群落分析采用非度量多维尺度分析（NMDS，一种降维排序方法）和置换多元方差分析（PERMANOVA，一种用于检验组间差异的非参数统计方法）。
3.1 培养物上宏条形码方法的评估
3.1.1 短读长Illumina方法的基准测试
通过对Chromochloris zofingiensis和Apusomonas proboscidea两种原生生物培养物进行V4宏条形码测试，研究人员发现短读长Illumina方法在属水平上的分类学错误分配率极低（0%至0.01%），并检测到可能的污染序列。
3.1.2 单条长读长的分类学分配
使用ONT R10.4.1化学试剂对培养物进行测序，并使用VSEARCH usearch_global进行分类学分配，结果表明长读长的分类学错误分配率同样极低（0%至0.01%），与短读长方法相当。研究还发现序列准确性与参考序列的相似度百分比高度相关，且即使准确率较低的序列也能获得高灵敏度的分类学分配。
3.1.3 长读长ONT读长质量预排序聚类的引入
为了减少测序错误对聚类的影响，研究人员提出了在VSEARCH聚类前按质量预排序读长的方法。与未排序聚类相比，该方法生成了更少但更大的序列簇，并提高了与参考序列的平均相似度，有效降低了测序错误对聚类效率的负面影响。
3.2 环境样本
3.2.1 基于短读长和长读长扩增子的聚类宏条形码
对26个葡萄园土壤样本进行测序和聚类，短读长Illumina方法产生6230个扩增子序列变异（ASVs，代表经过去噪和聚类后的分类单元），长读长ONT方法产生6487个操作分类单元（OTUs，代表基于序列相似度聚类的分类单元）。
3.2.2 原生生物群落
通过比较不同方法，研究发现长读长ONT方法在门水平上显示出更均匀的系统发育多样性分布。长读长方法未分类读长比例较高，主要是由于PR2数据库中覆盖V4-V9区的序列较少，而非测序错误所致。在属水平上，长读长个体分析检测到了更多Pythium物种。
3.2.3 Alpha多样性
稀释分析表明，短读长Illumina方法所有样本均达到饱和，而长读长ONT方法多数样本未饱和，聚类方法可能低估了属丰富度。长读长个体分析检测到的属数量是聚类和短读长方法的两倍，且测序错误并未显著夸大多样性估计。
3.2.4 Beta多样性分析
NMDS分析和PERMANOVA表明，长读长ONT方法，尤其是个体分配，揭示了原生生物群落与环境变量（如CaCO
3含量）之间更强的相关性，表明其增加的分辨率具有生物学相关性。
讨论部分指出，使用R10.4.1化学试剂的长读长ONT宏条形码已准备好用于原生生物群落分析，其分类学分配错误率可忽略不计。长读长宏条形码的主要挑战在于引物设计、长片段PCR扩增以及公共数据库中长参考序列的匮乏。研究建议，是否对读长进行聚类取决于研究目的：进行基于OTU的多样性分析或生成高质量共识序列宜选择聚类，而检测群落与环境参数的相关性或纳入稀有物种则首选个体读长分析。在聚类前按质量预排序读长可以最小化测序错误的影响。研究结论表明，长读长ONT宏条形码提供了比短读长Illumina宏条形码更稳健且优越的替代方案。扩增子长度增加的优势不再被测序错误抵消。当前长读长宏条形码的瓶颈主要在于公共数据库中高质量长参考序列的稀缺以及由此带来的通用引物设计困难。对培养原生生物的高质量全基因组测序将有助于克服这一限制。
