通过定量无标记比较蛋白质组学推进Dissulfuribacter thermophilus S69T中硫化合物歧化难题的解析

《Environmental Microbiology Reports》：Advancing the Resolution of the Sulfur Compound Disproportionation Puzzle in Dissulfuribacter Thermophilus S69? Through Quantitative Label-Free Comparative Proteomics

　　

在深海热液喷口（deep-sea hydrothermal vents, DSV），硫化合物（sulfur compounds）对微生物生物能学（microbial bioenergetics）至关重要。尽管对全球硫循环（global sulfur cycle）有显著影响，厌氧硫化合物歧化（anaerobic sulfur compound disproportionation）仍是最不明确的代谢过程，至今仅有三株细菌菌株在蛋白质组水平（proteomic level）上被研究过其硫歧化代谢。此处，研究人员呈现了化学自养硫循环物种（chemolithoautotrophic sulfur-cycling species）Dissulfuribacter thermophilus S69^T的比较蛋白质组学（comparative proteomics）研究。在硫代硫酸盐（thiosulfate）歧化条件下，蛋白质组学揭示了一个细胞质硫代硫酸盐还原酶AB同源物（cytoplasmic thiosulfate reductase AB homologue, PhsAB-like）的高丰度，该酶可能还原性裂解硫代硫酸盐为硫化物（sulfide）和亚硫酸盐（sulfite）。后续步骤可能涉及异化硫酸盐还原（dissimilatory sulfate reduction）途径中的酶，其中腺苷酰硫酸还原酶（adenylylsulfate reductase, Apr）和硫酸腺苷酰转移酶（sulfate adenylyltransferase, Sat）可能以反向（reverse）方式作用产生硫酸盐。菌株S69^T在亚硫酸盐/氢气条件下表现出增强的生长，这很可能归因于亚硫酸盐呼吸（sulfite respiration）和歧化（disproportionation）的同时发生。此处，一系列新酶丰度更高，包括一个含有NrfD蛋白的酶、MolyAB以及两个膜结合四硫酸盐还原酶（tetrathionate reductase, Ttr）同源物。其他膜结合氧化还原酶（membranous oxidoreductases），如QmoABC、DsrMKJOP和复合体I（Complex I），可能参与该途径，而自养生长（autotrophic growth）可能由Wood–Ljungdahl途径（Wood–Ljungdahl pathway, WLP）维持。这些发现凸显了菌株S69^T与之前经蛋白质组学表征的硫歧化菌株相比独特的酶学特征，揭示了值得进一步分析的新酶。

**研究背景与问题**
深海热液喷口（deep-sea hydrothermal vents, DSV）是海洋硫循环（sulfur cycle）的关键场所，其中硫化合物（sulfur compounds）的多种氧化态（oxidation states）驱动微生物能量代谢。厌氧硫化合物歧化（anaerobic sulfur compound disproportionation）是一种古老的代谢过程，可能早在太古宙（Archean）就已存在，对全球硫循环有重要影响。然而，该代谢途径的酶学机制仍不明确，目前仅有三株细菌（分别属于Desulfobacterota和Campylobacterota门）在蛋白质组水平（proteomic level）被研究过。Dissulfuribacter thermophilus S69^T（属于Desulfobacterota门中的Dissulfuribacteria纲）具有通过硫代硫酸盐（thiosulfate）、亚硫酸盐（sulfite）和元素硫（elemental sulfur）歧化生长的能力，但其相关酶学通路尚未被解析。为此，研究人员开展了这项比较蛋白质组学研究，旨在揭示该菌株在硫化合物歧化代谢中的关键酶和能量保存机制。

**研究内容与结论**
研究人员通过无标记定量比较蛋白质组学（label-free quantitative comparative proteomics），分析了S69^T在硫代硫酸盐歧化（thiosulfate disproportionation, S2O3D）和氢营养亚硫酸盐（hydrogenotrophic sulfite, hSO3）条件下的蛋白质组，并结合生长曲线和硫化合物浓度监测。结果表明，在S2O3D条件下，菌株生长较弱，但硫代硫酸盐被消耗并生成硫酸盐和硫化物；在hSO3条件下，菌株生长更快，亚硫酸盐逐步消耗，伴随硫代硫酸盐和硫酸盐的生成，提示亚硫酸盐呼吸（sulfite respiration）与歧化（disproportionation）同时发生。蛋白质组学分析共鉴定1737种蛋白质（占预测蛋白质组的71%），其中717种蛋白质丰度在两种条件间显著差异（fold change ≥ 1.5, adjusted p ≤ 0.05）。在S2O3D条件下，123种蛋白质丰度更高，包括细胞质硫代硫酸盐还原酶AB同源物（PhsAB-like）、YTD簇蛋白TusA、腺苷酰硫酸还原酶（AprAB）、硫酸腺苷酰转移酶（Sat）、异化亚硫酸盐还原酶簇蛋白DsrD等；在hSO3条件下，594种蛋白质丰度更高，包括含有NrfD的酶、MolyAB、四硫酸盐还原酶同源物（TtrBCA）、DsrMKJOP复合物、复合体I（Complex I）亚基、ATP合酶亚基、甲基紫精还原氢化酶（MvhAGD）和异二硫键还原酶（HdrAC2）等。基于这些数据，研究人员提出了硫歧化的暂定模型：在S2O3D中，硫代硫酸盐经PhsAB-like还原裂解为硫化物和亚硫酸盐；亚硫酸盐经AprAB和Sat反向作用氧化为硫酸盐，电子回馈至PhsAB；TauE/SafE家族蛋白可能参与亚硫酸盐输出。在hSO3中，亚硫酸盐呼吸和歧化共存，可能涉及多种钼蝶呤氧化还原酶（molybdopterin oxidoreductases）和DsrABC复合物，同时氢化酶和HdrAC2参与能量保存。该研究首次在蛋白质水平表征了第四种硫歧化微生物，揭示了硫歧化途径的镶嵌性（mosaic nature），即氧化分支由反向硫酸盐还原途径（reverse sulfate reduction pathway）介导，还原分支可涉及DsrABC、PhsAB或PsrABC等，并发现多种新型钼蝶呤氧化还原酶（如MolyAB、TtrBCA同源物等），为理解深海热液喷口硫循环的生态功能提供了重要见解。论文发表在《Environmental Microbiology Reports》。

**主要技术方法**
研究人员采用无标记定量比较蛋白质组学（label-free quantitative comparative proteomics）技术，结合纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）和DIA-PASEF（data-independent acquisition-parallel accumulation-serial fragmentation）模式，使用DIA-NN软件进行蛋白质鉴定和定量。样本来源：菌株S69^T（DSM 25762^T）分离自西南太平洋Lau盆地Valu Fa Ridge的热液喷口烟囱（hydrothermal vent chimney）。细胞培养在硫代硫酸盐歧化（S2O3D）和氢营养亚硫酸盐（hSO3）两种条件下，分别于指数中期收获，通过细胞分馏获得细胞质和膜蛋白组分，经蛋白酶解后进行质谱分析。数据过滤和统计使用MCQR R包，显著差异蛋白定义为fold change ≥ 1.5且adjusted p ≤ 0.05。

**研究结果**
**3.1 菌株在两种培养条件下均生长**
通过生长曲线和化学分析，研究人员确认S2O3D条件下硫代硫酸盐消耗伴随硫酸盐和硫化物生成，生长较弱（μ = 0.07 h^-1）；hSO3条件下亚硫酸盐逐步消耗，先积累硫代硫酸盐，后生成硫酸盐，生长更快（μ = 0.48 h^-1），表明同时发生亚硫酸盐呼吸和歧化。PIPES缓冲液对照实验证实无背景生长。

**3.2 比较蛋白质组学提供能量保存机制的见解**
共鉴定1737种蛋白质，占预测蛋白质组的71%。717种蛋白质丰度在两种条件间显著差异。在S2O3D下，123种蛋白质丰度更高，包括PhsAB-like、TusA、AprAB、Sat、DsrD等；在hSO3下，594种蛋白质丰度更高，包括NrfD-containing酶、MolyA、TtrBCA、DsrMKJOP、Complex I、ATP合酶、MvhAGD、HdrAC2等。碳代谢酶（如TCA循环、糖异生）在S2O3D下更高，而Wood–Ljungdahl途径（WLP）和乙醛酸循环酶在hSO3下更高。

**3.2.1 硫代硫酸盐歧化**
PhsAB-like（细胞质，无Tat信号肽）在S2O3D下丰度显著升高（log2FC 2.45-3.51），建议其催化硫代硫酸盐还原裂解为硫化物和亚硫酸盐。氧化分支可能由AprAB和Sat反向作用介导，电子回馈至PhsAB。TauE/SafE家族蛋白（log2FC 1.56）和关联蛋白可能参与亚硫酸盐输出。TusA（YTD簇）丰度升高，可能参与硫转移，但具体路径不明。

**3.2.2 氢营养亚硫酸盐培养条件下的反应**
多种钼蝶呤氧化还原酶丰度升高：NrfD-containing酶（log2FC -6.90）、MolyA（log2FC -2.09）、TtrBCA同源物（TtrA -1.89, TtrB -1.40）、新型Ttr同源物（DITHS69_0683-0684）。DsrMKJOP复合物（DsrP, DsrJ, DsrK, DsrM）丰度升高，可能参与电子传递至DsrAB。Complex I（Nuo亚基）和ATP合酶亚基丰度升高，支持增强的呼吸作用。MvhAGD和HdrAC2可能参与氢氧化和电子分叉，为WLP提供还原力。

**3.2.3 两种条件下代谢反应的暂定模型**
综合模型提出：S2O3D下，硫代硫酸盐经YedE或类似转运蛋白进入细胞质，由PhsAB-like裂解，亚硫酸盐经AprAB/Sat氧化为硫酸盐，电子循环；hSO3下，亚硫酸盐可能经多种钼蝶呤氧化还原酶（如TtrBCA、MolyAB）还原或歧化，同时氢化酶和HdrAC2参与能量保存，氧化分支同样涉及反向硫酸盐还原途径。

**结论与讨论**
研究结论指出，S69^T是第四个在蛋白质水平被表征的硫歧化微生物。其氧化分支很可能由异化硫酸盐还原途径的酶（AprAB和Sat）反向作用介导，这与已表征的三种Desulfobacterota菌株一致。还原分支在不同菌株中可涉及不同酶：在S69^T的S2O3D下为PhsAB-like，在hSO3下可能涉及DsrABC或多种钼蝶呤氧化还原酶（如TtrBCA、MolyAB、NrfD-containing酶）。这些发现揭示了硫歧化途径的镶嵌性（mosaic nature），即不同菌株招募不同酶模块（如“Lego blocks”或“redox kits”）来执行该代谢。未来需通过生化活性测定、突变体构建及放射性标记追踪等方法，进一步验证这些酶的功能，并探索菌株S69^T的完整代谢潜力（如S0氧化耦合DNRA、Fe(III)还原等）。这些结果加深了对深海热液喷口硫循环微生物生态功能的理解。